Способ модификации дезоксирибонуклеиновой кислоты Советский патент 1980 года по МПК C07H21/04 A61K31/711 

Изобретение относится к способам модификации нуклеиновых кислот, в частности к способу модификации: дез оксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) который может найти применение при структурном анализе нуклеиновых кис лот и в медицине, в частности при и готовлении вакцин. Известны способы химической моди фикации ДНК, например, путем обрабо ки ее раствором дифениламина в муравьиной кислоте, которые приводят к одновременному удалению пуриновых оснований из молекулы ДНК . Однако в литературе не описаны способы, которые приводят к селективному -отщеплению от ДНК аденина, что важно при структурном анализе нуклеиновых кислот. Целью изобретения является полу чение препаратов ДНК с заданным со держанием в ней аденина. Цель достигается тем, что ДНК инкубируют с соединением обшей фор мулы Е -СИ-NU-CHjOH где R. - СООН, ОН, Н; 2 - Н, СН,(СН2)п, где 0-5, R. -- - - - J при рН - 4-6 итемпературе 30-50 С в течение времени, которое определяют по константе скорости реакции ; ,4 р„ 100 t К 10 где t - время от начала инкубации, мин ; X - количество отщепившегося аденина, %; К - константа скорости реакции, значение которой определяется монометилольным производным амина, используемого для дезаденимизации ДНК, значением рН и температурой процесса. Предлагаемый Способ модификации ДНК, который приводит к получению препаратов ДНК с заданным содержанием аденина в ней, заключается в том, что ДНК инкубируют с соединением форму.пы I при рН 4-6 и температуре 30-50 С в течение времени, которое определяют по константе скорости реакции. Реакцию модификации предпочтительно проводят следующим образом.

ДИК инкубируют с соединением формулы 1, которое является продуктом взаимодействия формальдегида и амина, предпочтительно с 0,4 М раствором монометилолглицина (R -СООН, RJ-H), при рН 4-6, предпочтительно 5,5, и температуре ЗО-ЗО С, предпочтительно 50°С.

При значениях рН, меньших 4, резко возрастает скорость неспецифического отщепления от ДНК пуриновых оснований 1. При значениях рН, больших б, скорость отщепления аденина от ДНК под действием монометилольных производных аминов значительно уменьшается.

Увеличение температуры выше вызывает ускорение процесса неспецифического отщепления цитозина, а уменьшение температуры инкубации ниже 30° С - зз едление процесса отщепления аденина от ДНК под действием монометилольных производных аминов.

Пример . Ниже приводятся ус.ловия, в которых происходит избирательное отщепление аденина от ДНК, вплоть до практически полного его удаления, под действием монометилольных производных глицина 3-аланина и этаноламина.

Монометилольные производные амина получают при взаимодействии глицина, fb-аланина или этаноламина (х. ч, Reanal, Венгрия) с формальдегидом. Последний готовят из фармацевтического формалина (Merk, ФРГ) . Концентрацию формальдегида определяют йодометрическим методом. Все растворы готовят на 0,1 М натрийфосфатно буфере с таким рН, чтобы после добавления всех компонентов и завершения

реакции формальдегида с амином рН реакционной смеси был равен 4-6,

Молярная концентрация амина в реакционной смеси превышает молярную концентрацию формальдегида в 3 раза, что обеспечивает полное связывание альдегида амином с образованием моном тилольного производного амина в концентрации, равной исходной концентрации добавленного к раствору формальдегида.

Для анализа препаратов ДНК, полученных при обработке монометилольным производными глицина Ь -аланина или этаноламина, используют метод ионообменной хроматографии на ДЭАЭ-целлюлозе в сочетании с хроматографией на бумаге.

Термоденатурированную ДНК в концентрации 2,5 мг/мл инкубируют в течение 3 суток, 1,2,3,6 недель в 0,1 М натрийфосфатном буфере с 0,4 М монометилольным производным глицина/ |3 1 -аланина или этаноламина при 30, 36 или 50°С и при рН 4,0; 5,5 или 6,0, Полученный препарат (1 мл) наносят на колонку с ДЭАЭ-целлюлозой (VlOO см) и элюируют 0,01 М натрийфосфатным буфером. В элюате присутствует только аденин. Кроме него определяемые количества других оснований не обнаруживаются. За появлением аденина следят спектрофотометрически.

Спектрофотометрические характеристики вещества,снимаемого с ДЭАЭ-целлюлозой 0,1 М натрийфосфатным буфером (рН 6,8) при хроматографии ДНК, обработанной монометилольным производным глицина (ММГ), приведены в табл. 1 .

Т а

лица

260 285 0,77 0,128 0,77 0,37 0,63 0,59 0,76 0,12 0,76 0,37. 0,57 0,60

Результаты, полученные в опыте.

ч

Литературные данные для аденина в этих условиях.

Связавшуюся с ДЭАЭ-целлюлозой ДНК снимают 1 М хлоридом натрия с 7 М мочевиной, обессоливают и гидролизуют 85%-ной муравьиной кислотой (175°С, 90 мин). Гидролизат хроматографируют на бумаге в кислом растворителе Кирби (метанол: концентрированная ВСЕ: Н20- 7:2:1) и анализируют нуклёотил ный состав гидролизата, Результаты приведены в табЛо.2-6.

Результаты по кинетике выщепленип аденина из ДНК под действием монометилольных производных аминов позволяют рассчитать кор1станту скорости этого процесса. Например, в условиях опыта, результаты которого приведены в табл. 6 (0,4 М монометилолглицин, рН 5,5, температура 36°С), К « 7,5 10 мин , Такая скорость в 1000 раз превышает скорость неспецифического

отщепления аденина от ДНК в соответ- ствующих опыту условиях, но в отсуттвии ММГ.

Данные о скорости процесса деза- денинизации ДНК под действием монометилольных производных аминов поз-j воляют заранее рассчитывать время инкубации для получения препаратов ДНК с заданным соедржанием аденина в ней по формуле (1). Величины К для тех случаев обработки ДНК, которые приведены в примерах, представлены в табл. 2-6.

Процентное содержание оснований в молекуле ДНК после инкубации ДНК с 0,4 М монометилолэтаноламином в 0,1 М натрийфосфатном буфере при рН 4,0 и температуре 36°С дано в табл. 2.

Таблица 2

3 суток 10,6 37,4 23,9 28,1 63 1 неделя 3,6 39,8 24,2 32,4 89

Примечание : ,0

Процентное содержание оснований в молекуле ДНК после инкубации ДНКс 0,4 М монометилол-р)-аланином в 0,1 М натрийфосфатном буфере при рН 4,0 и температуре 30 С дано в табл. 3.

Т а

лица

7,0.

Примечание

К

Процентное содержание оснований в молекуле ДНК после инкубации ДНК с 0,4 М мономотилолглицином в 0,1 М натрийфосфатном буфере при рН 5,5 J5 температуре 50°С дано в табл. 4,

Т я блица

3 суток .14,4 34,4 26,0 25,2 50 д 1 неделя 5,0 40,2 28,6 26,2 85

Примечание: Кг 1,3.

Процентное содержание оснований в молекуле ДНК после инкубации ДНК с 0,4 М монометилолглицином в 0,1 М натрийфосфатном буфере при рН 6,0 и температуре 50 С дано в табл. 5.

Таблица

3 суток 20,0 31,5 24,5 24,0 29

1 неделя 13,5 34,2 26,4 25,9 53

3 недели 2,9 41,6 30,0 25,5 90

Примечание: Кж2,9. Процентное содержание оснований в молекуле ДНК после инкубации ДНК с 0,4 М монометилолглицином в 0,1 М натрийфосфатном буфере при рН 5,5 и температуре дано в табл. 6.

т а б л иц а

eg Исходная

. Примечание: К 4,15. . Формула изобретения

RJ-CH-WH-CH OH RI

где R - СООН, ОН, Н;

Rg - Н, CH(CHj,)f,, где п 0-5, при рН 4-6 и температуре ЗО-ЗО С в течение времени, которое определя по константе скорости реакции , „ ,f. п 100

t К- 10 .Eg -foo::

где t - время от начала инкубации, мин ;

X - количество отщепившегося аденина, %;

К - константа скорости реакции, 2. Способ ПОП.1, отличающийся тем, что в качестве исходного реагента используют соединение формулы 1, где. R - СООН, R Н.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1. Кочетков Н.К., Будовский Э.И., Свердлов Е.Д., Симукова Н.А., Турчинский М.Ф., Шибаев В.Н. Органическая химия нуклеиновых кислот. М., Химия, 1970, с. 500-503 (прототип) .