Способ получения противореагинового иммуноглобулина Советский патент 1980 года по МПК A61K39/00 

1

Изобретение относится к области медицины, а именно иммунологии.

Известен способ получения противореагинового иммуноглобулина путем иммунизации животных, с последующим отделением сыворотки крови, ее очисткой и выделением целевого продукта 1.

Однако известный способ является трудоемким.

Целью изобретения является упрощение способа.

Эта цель достигается тем, что животных иммунизируют суммарной фракцией лимфоцитов, выделенных из миндалин, аденоидов, бронхиальных или мезентериальных лимфатических узлов, а очистку ведут с помощью иммуносорбции суспензией Т-лимфоцитов и сывороточными глобулинами типов G, А, М, Д.

Пример. Приготовление суммарной лимфоцитарной фракции.

Лимфоциты получают из брыжечных лимфоузлов кроликов. Лимфоузлы извлекают, обезжиривают и помещают в предварительно охлажденный раствор Хенкса. Лимфоциты из собранных лимфоузлов выделяли по методике А. Agastom. Лимфоузлы окончательно очищают от жировых и соединительных тканей и измельчают ножницами до пастообразной консистенции в холодной камере при температуре . Измельченную массу заливают двумя объемами 5 раствора Хенкса и во избежание поврежде-. ния клеток, вместо гомогенизатора встряхивают в колбе 5 мин. Полученную массу фильтруют через двойной слой капроновой ткани. Полученный фильтрат центрифугируют в течение 15 мин в рефрижераторной

10 центрифуге при -V 4°С и при 1000 об/мин, так как 2500 об/мин вызывает слипание клеток. Надосадочную жидкость сливают, а из полученных лимфоцитов делают по четыре мазка для контроля.

20 мл клеток смешивают с 30 мл SMEP

15 и добавляют к полученной взвеси 140 мл 95%-ного глицерина для микроскопии с 0,003 мл насыщенного раствора хлористого магния (MgClj, 0,005 М). SMEP готовили путем растворения при нагревании 1,488 г

20 0,004 М ЭДТА в 65 мл 0,00 М раствора однозамещенного фосфата натрия (ЫаНгРОЛ, добавляя сахарозы 0,24 М 82,152 г и 1000 мл дистиллированной воды. Все растворы употребляют в охлажденном виде. Таким способом подготовленная смесь лимфоцитов хранилась до иммунизации при -20°С. Перед иммунизацией лошади SMEP и глицерин трижды смывают физиологическим раствором и центрифугируют. Противореагиновуюантисыворотку (ПРС) получают путем иммунизации лошади. Лошадь иммунизируют 1, 3, 6-й день 30 мл взвеси лимфоцитов (что составляет 4 -10 клеток) с 30 мл адьюванта Фрейнде. На 8, 9, 13, 23 и 25-й день лошадь иммунизируют тем же количеством клеток на физиологическом растворе, но без адьюванта. На 10-й день после последней иммунизации лошадь обескровливают в стерильные цилиндры на 1000 мл. С целью увеличения ретракции сгустка применяют специальные гири. Полученную антилимфоцитарную сыворотку (АЛС) инактивируют при 56°С 30 мин. Очистку полученной антисыворотки проводят с помощью иммуноадсорбции антисыворотки Т-лимфоцитами. Удаление из антисыворотки антител к другим классам иммуноглобулинов осуществляют с помощью глюторальдегидного иммуносорбента. Выделение противореагинового антитела (ПРГ) осуществляют из ПРС спиртовым методом. Все процессы выделения глобулинов проводят в условиях, близких к стерильности, в сосудах из нержавеюп ей стали, в камерах при температуре ниже 0°С, медленно добавляя этиловый спирт в АЛС до 26% при рН 6,8-7,2 и температуре -10°С, выпадает в виде осадка фракция гаммаглобулинов с примесью. Осадок растворяют дистиллированной водой и добавляют спирт до концентрации 13% при рН 5,1 и температуре от -5 до -6°С. В осадок выпадают бета-глобулины и небольшое количество альбумина, альфа-глобулина и гамма-глобулина. В растворе остается очищенный гамма-глобулин. Добавляют спирт до концентрации 26% при рН 7-7,2 и температуре - 10°С, в осадок выпадают очищенный гамма-глобулин. С целью удаления спирта проводят лиофилизацию. Из сухой субстанции готовят 5%-ный раствор ПРГ. В качестве растворителя применяют физиологический раствор. Изготовленные растворы подвергают стерилизирующей фильтрации и биологическому, а также химическому контролю (стерильность, апирогенность, безвредность, содержание белка, электрофоретическая однородность) по требованию регламента производства человеческого гамма-глобулина. Предлагаемый способ позволяет получить эффективную Противореагиновую антисыворотку в больших количествах, используя в качестве источника антигена легко доступные источники (гланды, аденоиды, мезентиральные лимфоузлы), и не требует для получения антисыворотки предварительного фракционирования и очистки, является менее трудоемким, Формула изобретения Способ получения противореагинового иммуноглобулина путем иммунизации животных, с последующим отделением сыворотки крови, ее очисткой и выделением целевого продукта, отличающийся тем, что, с целью упрощения способа, животных иммунизируют суммарной фракцией лимфоцитов, выделенных из миндалин, аденоидов, бронхиальных или мезентериальных лимфатических узлов, а очистку ведут с помощью иммуносорбции суспензией Т-лимфоцитов и сывороточными глобулинами типов G, А, М, Д. Источники информации, принятые во внимание при экспертизе 1. J. DmmunologY, 13,1967, р. 38.