Штамм вкмв 548-продуцент фермента глутаминазы- аспарагиназы Советский патент 1980 года по МПК C12K1/02 C12D13/10 

(54) ШТАММ PSEUDOMONAS AURANTIACA ВКМВ 548 ПРОДУЦЕНТ ФЕРМЕНТА ГЛУТАМИН ЗЫ-АСПАРАГИНАЗЫ

1

Изобретение относится к микробиологическому производству глутаминаэы-аспарагиназы и может быть применено в микробиологии, медицине, ферментной медицинской промышленности.

Одной из основных проблем современной медицины является поиск новых лечебных препаратов, Облалающих противоопухолевой активностью. Перспективными являются поиски препаратов микробного происхождения.

Известно, что фермент глутаминаза-аспарагиназа (КФ 3,5 Л. 38) в отличие от других дезамидаз катализирует гидролиз как L-глутамина, так и L-аспарагина, способен подавлять рост некоторых опухолей, устойчивых к действию - аспарагиназ

Известен штамм Pseudomonas f uo- rescens, a также ряд других культур, продуцирующих глутаминазу-аспарагиназу. Однако их недостатком является невысокая активность обра3yeNajx ферментов }.

Наиболее близким по технической сущности к заявленному является штамм Pseudomonas boreopoEis ,

Недостатком этого штамма также является недостаточно высокая активiHOCTb глутаминазы-аспарагиназы и сравнительно длинный цикл развития гщрбдуцента (22-24 часа),

Целью настоящего изобретения является штамм того же рода Psejido- monas, синтезирующий высокоактивные внутриклеточные ферменты и отвечающий требованиям, предъявляе1«елм к про дуцинту.

Предлагаемый штамм хранится в коллекции культ тэ микроорганизмов института микробиологии АН СССР пгц номером ВК МБ 548.

Штамм Pseudomonas aurantiaca

15 ВКМВ 548 - продуцент глутаминаэыаспарагиназы на агаризованной среде (МПА с 1% глюкозы) образует колонии оранжевого или красно-желтого цвета, гладкие, блестящие, плоские и-выпуклые. Пигмент выделяется в среду, окрашивая ее в зеленовато-красный флюоресцирующий цвет. Клетки в молодых культурах палочковидные, средних размеров 2-3 х 0,6 нм, подвижные, имеют на конце 2-5 жгутиков.

Штамм хорошо растет на МПБ с 1% глюкозы, усваивает минеральный азот так же хорошо, как и органический. Из источников углерода хорошо усваивает глюкозу, глицерин. Аспарагиновую и глутаминовую кислоты использует в качестве углерода и азота.

Агар не разжижает, желатину разжижает энергично, молоко не свертывает, но пептониэирует, нитраты не восстанавливает, крахмал не раэла гает, Аэроб; оптимум теьшературы 28-

29 С, хорошо растет и при температуре 25-27 С.

Сравнительные данные активностей известного и предложенного штаммов (МПБ с 1% глюкозы)

Pseudomonas boreopoiis

526 (известный штамм) 0,48

Pseudomonas auran- tiaca 548 (предложенный штамм Как видно из таблицы, предлагаемы штамм Pseudomonas aurantlaca 548 отличается более высокой глутаминазной и аспарагиназной активностями и образованием максимального количества фермента в более ранний срок культивирования (18 час), по сравнению с известным штаммом (23-24 часа Пример. Штамм Pseudomonas aurantiaca ВКМВ 548, выросший на среде известного состава, содержащей МПА с 1% глюкозы, вносят с помощью бактериальной петли в посевную среду того же состава и культивируют глубинным способом при рН 7,2-7,4 в течение 18 часов при рН 7,2-7,4 при 28-29 в качалочных колбах емкостью 250 мл (объем среды 100 мл). Затем посевной материал в количестве 5% вносят в среду того же состава и выращивают тем же способом в течение 18 часов. Пример. Штамм Pseudomonas aurantiaca ВКМВ 548, выросишй на среде известного состава, содержащей МПА с 1% глюкозы, вносят с помощью бактериальной петли в посевную неагаризованную среду того же состава и культивирует глубинным способом при рН 7,2-1,А в течение 18 часов пр температуре - 28-29°С в качалочных колбах емкостью 250 мл (объем среды 100 мл). Затем посевной материал в количестве 5% вносят в среду известного состава, содержащую (г/л - при 5-6 тыс. об/мин (10-15 минут) глутамат натрия - 20, КН РО, - 13,6 MgSO,., 7Н5,О - 0,2; FeCj - 0,6 MnCdj, 4H,jO - 0,6 ZnCl - 0,6; CuS04 - 0,6 СаСе2Н - 0,6 NaC|, - 0,6 рН 7,2-7,4 и выращивают тем же способом в течение 18 часов при температуре 28-29 С.

Образует красно-оранжевый пигмент, растворимый в спирте и в воде. Оптимальная реакция среды 7,2-7,4. Может развиваться и прн рН 7,6-7,8.

При сравнении с известным штаммом Pseudomonas boreopo is 526 предлагаемый штамм имеет следующие величины глутаминазной и аспаразинаэной активностей.

О, 48

0,86

0,95

1,52

2, 36

1,41

2,60 Биомассу отделяют от культуральной жидкости центрифугированием при 5-6 тыс. об/мин (10/15 минут), прозывают холодной водопроводной водой (2 раза) и осадок переносят в ступки в небольшом количестве трис буфера (рН 7,2) (1-2 мл), тщательно размешивают и замораживают при температуре - 10 в течение суток. Затем замерзшую биомассу разрушают растиранием в ступке, разводят гомогенат; 2 мл трис буфера и центрифугируют 10 минут при 8 тыс. об/мин. Содержание белка в пробе определяют по Лоури. Затем определяют активность фермента, используя в качестве субстратов глутамин и аспарагин (27 мкмоль/мл) и измеряя концентрацию NH д колориметрически с реактивом Несслера. Удельную активность фермента выражали в мкмолях NHj, выделившегося за 1 минуту на 1 мг белка. Использование предлагаемого штамма по сравнению с известными культурами имеет следуювоие преимущества: короткий цикл развития продуцента и увеличение глутаминазной и аспарагиназной активностей (см.табл.). Формула изобретения UJraMM Pseudomonas aurantiaca ВКМВ 548-продуиент фермента глутаминазы-аспарагиназы, хранится в коллекции культур микроорганизмов института микробиологии АН СССР. Морфологические признаки. Клетки в молодых культурах палочковидные, средних размеров 2-3 х 0,6 нм, подвижные, имеют на конце 2-5 жгутиков.

Физиологические признаки. На МПА с 1% глюкозой образует олонии оранжевого или красно-желтого цвета, гладкие, блестящие, плоские и выпуклые. Пигмент проникает в субстрат, окрашивает его в зеленоватокрасный флнюресцирующий цвет, Колонии плохо снимаются петлей.

На МПБ с 1% глюкозой дает также хороший рост с образованием краснокоричневого пигмента.

На синтетической среде с глутаматом натрия рост хороший. Среда окргииена в розово-желтый цвет.

Отношение к углеводам. Хороию усваивает глюкозу, фруктозу, мальтозу, лактозу, ксилозу, арабинозу, ранозу, ггипактозу.

Отношение к органическим кислота Усваивает сукцинат, лактат, цитрат, глутамат, зспартат.

Отношение к азотистым веществам. Усваивает минеральный азот так же хорошо, как и органический.

Агар разжижает, желатину разжижает энергично, молоко не свертывает, не пептонизирует. Нитраты не восстанавливает, крахмал не разлагает.

Образует красно-оранжевый пигмент, растворимый в спирте и в воде. Аэроб, оптимум температуры роста - 28-29 с. Фермент глутаминаза-аспарагиназа внутриклеточный.

Глутаминазная активность штамма Pseudomonas aurantiaca ВКМВ 548 на сложной среде (МПБ с 1% глюкозы) составляет 5-6 МЕ/мг, на синтетической среде с глутаматом натрия - 3-5 МЕ/мг.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

Т.Т, Березов, 1976. Прикладная биохимия и микробиология, XII, ВЫП.1,

стр. 14 - прототип.