Способ количественного определения никотиновой кислоты в жидкой питательной среде Советский патент 1980 года по МПК C12K1/00 

Иэобретение относится к медицине а именно микробиологии. Известен способ количественного определения никотиновой кислоты в жидкой питательной среде путем внес ния в нее тест-культуры с последующим инкубированием и определением количества никотиновой кислоты по мутности среды Однако известный способ обладает недостаточно высокой точностью. Целью изоб)етенияг является повышение точности способа. Эта цель достигается тем, что в качестве тест-культуры используют штамм Gersinia pestis 1300 Nic ил штамм Gersinia pestis EV 28/8 Nic. Никотинадмидзависимый мутант G. pest is 1300-215 Nic получен из вирулентного штамма 1300 после воз действия нитрозометилмочевиной из числа вариантов, устойчивых к налид ксовой кислоте. Мутант 1300-215 Nic обладает ст бильно высокой избирательной реакцией на никотиновую кислоту. Штамм Gersinia pestis 1300-215 .депонирован в коллекции Всесоюзно ордена Трудового Красного:Знамени налид научно-исследовательского противочумного института Микроб. Штамм Gersinia pestic 1300-215 Nic характеризуется следующими культураль,но-морфологическими и физиологобиохимическими признаками. Культурально-морфологические признаки. Полиморфные грамотрицательные палочки с закругленными концами размером 1-2 мкм в длину и 0,3-0,5 мкм в ширину. Жгутиков не имеет, спор не образует. Бульон Хоттингера. Хлопьевидный осадок, бульон прозрачный. Агар Хоттингера. Образует колонии сероватого цвета диаметром 0,5-2 мм с приподнятым зернистым центром и фестончатой периферической зоной. .Физиолого-биохимические признаки. Оптимум роста 26-28с. Ферментирует с образованием кислоты без газа глюкозу, мальтозу, маннит, арабинозу, галактозу, маннозу. Восстанавливает нитриты в нитраты. Желатину не разжижает. Индол не образует.

Сероводород вьщеляет. Продуцирует пестицин 1. Среда Джексона-Берроуза с геиином, Обраэуёт непигментированные колонии

Требует для роста наличия в питательной среде лейцина, метионина, фенил ал анина, , цистеина и никотиновой кислоты или никотинамида

Вирулентные свойства.

Авирулентен для белых мышей при подкожном введении от 10 до 10 микробных клеток и для морских свинок до 10 микробных клеток.

Никотинамидзависимый мутант G. pestis EV 28/8 Nic получен из вакцинного штамма EV после, воздёйствия нитрозометилмочевиной из числа вариантов, устойчивых к налидисовой кйСЛотё.

Мутант 28/8Niс обладает стабильно высокой избирательной реакцией на никотиновую кислоту.

Штамм Persinia pestis 23/8 Nlc депонирован в коллекции Всесоюзного ордена Трудового Красного Знамени научно-исследовательского института Микроб.

Штамм Gersinia pestis 28/8 Nlc характеризуется следующими культурально-морфологическими и физиолотобиохимическими признаками.

Культурально-морф.оЛогическиё признаки.

Полиморфные грамотрицательные палочки с закругленными концами размером 1-2 мкм в длину и 0,3-0,5 мкм в Ширину. Жгутиков не имеет, спор не образует.. ,

Бульон Хоттингера. .Хлопьевидный осадок, бульон прозрачный. Агар Хоттингера. Образует колонии сероватого цвета диаметром 0,5-2 мм с приподнятым зернистым центром и фестончатой периферической зоной.

Физиолого-биохимические признаки.

Оптимум роста 2б-28°С.

Ферментирует с образованием кислоты без газа глюкозу, мальтозу, маннит, арабинозу, галактозу, маннозу.

Восстанавливает нитриты в нитраты.

Желатину не разжижает.

Индол не образует.

Сероводород вьщеляет.

Продуцирует пестицин 1. .

Среда Джексона-Верроуза;с гемином Образует непигментйрованные колонны.

Требует для роста наличия в питательной среде лейцина, метионина, фенилаланина, треонина, цистеина и никотиновой кислоты или никотинамида

Вирулентные свойства.

Авирулентен для белых мышей при подкожном введении от 10 до 10® микробных клеток и для морских сви-, нок до 10° микробных клеток.

Пример. В качестве основной среды используется синтетическая среца на фосфатном буфере М/15 рН 7,17,2. Непосредственно перед опытом вносят стерильно в 100 мл основы следунлцие компоненты: 0,5 мл 20%-ного раствора (NN4)504, 0,25мл 10%-ного

j MgSO , 0,5 мл 40%-ноЙ глюкозы, раствор сульфита натрия до концентрации 0,1% и аминокислоты (лейцин, метионин, треонин, фенилаланин и цистеин) в дозах 0,01 мг/мл. Готовят дна параллельных ряда пробирок с последовательными десятикратными разведениями исследуемой питательной среды. Разводят до 10 основной синтетической средой без добавления . никотиновой кислоты.

5 Для построения стандартной кривой роста тест-штамма также два параллельн1лх ряда пробирок заполняют по 4,5 мл основной синтетической среды с добавлением никотиновой кислоты, в количествах 10, 10, 1, Ю , 10, 10, 10 мкг/мл. Затем в каждую, пробирку как,в опытном, так и в стан. дартных .рядах,вносят по 0,5 мл истой1енной суспензии тест-штамма,

5 создавая посевную концентрацию

200 млн. мк./мл. Посевы помещают в термо стат при 28с.

После выдерживания посевов в теQ чёние суток производят ежедневное определение интенсивности роста тест-штамма путем измерения мутности среды с помощью нефелометра. По достижении максимальных показаний прибора и появлении тенденции к снижению опыт прекращают.

С целью снятия показаний нефелометра непосредственно с пробирок, выпиливcUOT специальные черные эбонитовые вкладыши с окнами для светового пучка, которые позволяют в течение длительного времени наблюдать посевы в жидких средах,не нарушая их стерильности.

5 Стандартную кривую вычерчивают на основе средних показаний из двух определений мутности в нефелометре для каждой точки стандартного раствора витамина. На оси абсцисс«отклап дывают десятичные логарифмы кс нцентраций витамина, на оси наносят средние, значения показаний прибора. Соединяя точки пересечения, получают стандартную кривую, характериЗующую ответную реакцию тесткультуры в зависимости от концентрации никотиновой кислоты в среде. Пользуясь ею путём экстраполирования определяют содержание витамина в миллилитре испытуемого раствора для

0 каяотой трчки.

Использование изобретения позволяет определить никотиновую кислоту в пределах до Ю , что на порядок превосходит чувствительность известного способа. . 5 745 Формула изобретения Способ количественного определения никотиновой кислоты в жидкой питательной среде путем внесения в нее тест-культуры с последующим ийкубированием и определением количества никотиновой кислоты по мутности среды, отличающийся тем, что, с целью повышения точности 9416 способа, в качестве тест-культуры используют штамм Gersinia pest i с 1300-215 Nic или Gersinia pestis EV 28/8 . Источники информадии, 5 принятые вовнимание при экспертизе 1. Одинцова Е.И. Микробиологические методы определения витаминов, м., 1959, с. 184-195.