Штамм YeRSINIa реSтIS EV-94тнY,используемый для определения тимидина в питательных средах Советский патент 1987 года по МПК C12N15/00 C12Q1/04 C12N15/00 C12R1/01 

Изобретение относится к медицинской микробиологии и-может быть использовано лри контроле качеХ:тва питательных сред.

Цель изобретения - создание нового штамма, обладающего высокой чувствительностью к экзогенным добавкам тимидина.

Штамм EV-94 thy- получен воздей- IQ ствием N-нитрозометилмочевины на вакцинный штамм EV 76 линии НИИЭГ с последующей селекцией среди устойчивых к триметоприму вариантов, нуждающихся в тимидине.

Штамм lersinia pestis EV-94 thy- хранится в Музее живых кул1,тур Всесоюзного ордена Трудового Красного Знамени научно-исследовательского

маннозу,галактозу,манит и не ферментирует сахарозу, дульцит, рамнозу, сорбит, лактозу и глицерин, Лизируется g чумным диагностическим фагом, фагами Л-4 1 3 , Т-7 и Д Эрелля. Синтезирует при 28 С пестицин, фибринолизин п плазмокоагулазу. На среде Джексона - Берроуза формирует колонии, которые не сорбируют г емин. При 37°С синтезирует антиген фракцию 1.

При подкожном и внутрибрюгаинном введении 10 -10 микробных клеток

гибели лабораторных животных не вы- 15 зывает. При определении плазмидного состава штамма методом электрофореза в геле агарозы отличий от родительского штамма не обнаружено. Клетки штамма устойчивы к триметоприму противочумного института Микроб под 20 (50 мкг/мл) и чувствительны к полиномером КМ-161 и характеризуется еле- миксину. дующими признаками. Пример. Определение тимидина

Культурально-морфологические приз- осуществляют как в жидких средах наки.пробирочным методом в ряду стандарт25 ных растворов тимидина в пределах 0,1-10 мкг/мл, так и в плотных средах чаи ечным методом в ряду стандартных концентраций тимидина от 0,2 до 50 мкг/мл.

30 Определение проводили в синтетической среде, приготовленной на осКлетки в мазках, окрашенных по Граму, имеют вид полиморфных грамо- .трицательных па.почек овоидной формы размером 0,,7 мк, в мазках из бульона встречаются биполярно окрашенные клетки, расположеннь е цепочками: жгутиков клетки не имеют.

На поверхности агара Хотти}1гера с добавлением 10 мкг/мл тимидина (рН 7,1-7,2) KJieTKH штамма формируют при колонии в R-форме с типичной для чумного микроба морфологией.

В бульоне культура штамма дает придонньй агглютинативный рост в виде хлопьев, среда при этом остается прозрачной.

На минимальной среде с L-метиони- ном, L- В-фенил-d -аланином и тими- дином при высеяв взвеси,содержащей

35

40

нове ьшнимальной солевой среды (М-9), г: , 3; NanPO 6; NaCl 0,65; Nn Cl 1, дистиллированной воды - до 1 л, устанавливают рН 7,1 и стерилизуют а1 токлавированием при 115°С (0,5 атм) 30 мин. Добавляют стерильные растворы: 10%-ного магния сернокислого - 2,5 мл/л,- 10%-ного натрия сульфита - 10 мл/л; 10%-ного аммония сернокислого - 5 мл/л; 10%-ной глюкозы - 5 мл/л; 1%-ные растворы т аминокислот в L-форме: фенилаланина, Метионина, цистеина, треонина, вали- 4g на, лейцина, изолейцина, лизина, тирозина, триптофана, аспарагина.

10

или

Ю клеток в 1 мл, через 46 дней инкубации при 28 С формирует типичные полупрозрачные беловатые колонии .размером до 1,5 мм. Па минимальной среде без тимидина рост стабильно отсутствовал даже при высеве 1 10 клеток.

Физиолого- биохимические признаки.

Ауксотроф. Для роста на мнималь- ной синтетической среде (М-9) при 28°С нуждается в тимидине и, как его родительский штамм, в L-мстионине и L- р -фенил- сЛ -аланине.

Ферментирует с образованием кислоты без газа глюкозу,арабинозу,мальтозу.

маннозу,галактозу,манит и не ферментирует сахарозу, дульцит, рамнозу, сорбит, лактозу и глицерин, Лизируется чумным диагностическим фагом, фагами Л-4 1 3 , Т-7 и Д Эрелля. Синтезирует при 28 С пестицин, фибринолизин п плазмокоагулазу. На среде Джексона - Берроуза формирует колонии, которые не сорбируют г емин. При 37°С синтезирует антиген фракцию 1.

При подкожном и внутрибрюгаинном введении 10 -10 микробных клеток

5

0

нове ьшнимальной солевой среды (М-9), г: , 3; NanPO 6; NaCl 0,65; Nn Cl 1, дистиллированной воды - до 1 л, устанавливают рН 7,1 и стерилизуют а1 токлавированием при 115°С (0,5 атм) 30 мин. Добавляют стерильные растворы: 10%-ного магния сернокислого - 2,5 мл/л,- 10%-ного натрия сульфита - 10 мл/л; 10%-ного аммония сернокислого - 5 мл/л; 10%-ной глюкозы - 5 мл/л; 1%-ные растворы т аминокислот в L-форме: фенилаланина, Метионина, цистеина, треонина, вали- g на, лейцина, изолейцина, лизина, тирозина, триптофана, аспарагина.

Готовят два параллельных ряда пробирок с последовательными десятикрат- разведениями исследуемой питательной среды. Разводят до 10 мини0

5

мальной средой без добавления тимидина.

Для построения стандартной кривой роста тест-штамма два параллельных ряда пробирок заполняют по 4,5 мл синтетической минимальной среды с добавлением тимидина в концентрациях 100; 10,1i 0,1; 0,01 мкг/мл. Затем в каждую пробирку как в опытном, так

и в стандартных рядах вносят по 0,5 мл суспензии кул1-туры тест-штамма концентрацией 5-10 клеток/мл, омытых центрифугированием в физиологическом растворе. Посевы инкубируют при 28°С в течение 48 ч, после чего производят регистрацию интенсивности роста штамма путем измерения мутности среды с помощью нефелометра или фото- эле к тр о колориметра.

Наибольшая чувствительность тест- культуры наблюдается в пределах 0,3- 50 мкг7мл тимидина в среде.

Помимо контроля за качеством сред, 1а также определения тимидина в различных биологических жидкостях, штамм lersinia pest is KM-161, зависимый от

ор i.Touтин 5164/25

Составитель Г.Смирнова Техред Л.Олийнык

Корр Подп

Тираж 499 ВНИИПИ Государственного комитета СССР

по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж-35, Раушскаянаб., д. 4/5

Произволственно-полиграфическое предприятие, г.Ужгород, ул.Проектная,4

тимидина, найдет широкое применение для решения вопросов бестиминового мутагенеза у чумного микроба, выяснения причин гибели клеток при бестиминовом голсу Дании, получении меченной по Н - ти- мидину хромосомной и плазмидной ДНК во всевозможных генетических экспериментах штамма.

Формула изобретения

Штамм lersinia pestis EV-94 thy - КМ-161 (Музей живых культур Всесоюзного -научно-исследогательского противочумного института Микроб), используемый для определения тияидина в питательных средах.

Корректор А.Обручар Подписное

Изобретение относится к медицинской микробиологии и направлено I a создание нового штамма, обладающего высокой чувствительностью к экзогенным добавкам тимидина. Штамм lersi- nia pestis EV-94 thy получен путем воздействия N-нитрозометилмочевины на вакцинный штам EV 76 с последующей селекцией среди устойчилых к тпи- метоприму вариантор, нуждающихся в тимидине. Штамм lersinia pestis КМ- 161 хранится в Музее живых культур ВНИПЧИ Микроб, Штамм 1 предназначен для oпpeдeJfcни l , ржания тьмидина в питательных срел- х. СО .1ф со со Ci CD