Среда для определения зараженности почвы Советский патент 1980 года по МПК C12K1/06 

Изобретение относится к области сельского хозяйства, в частности к определению запаса инфекции фитопатогенных грибов в почве. Известны различные среды для выделения и подсчета микроскопических грибов в почве Ij . Известна также среда для количест венного подсчета F.oxysporum, в которую входят азотнокислый натрий, фосфорнокислый калий двуявмещенный, хлористый калий, сернокислый магний сернокислое железо закисное, сахаро за, дрожжевой экстракт, фосфорная кислота, стрептотлицин, агар, вода. Эта среда также как упомянутая выше обладает существенным недостатком - зарастает соответствующими почвенным грибами, вследствие чего малопригод на для анализа полевой почвы 2. Цёль изобретения - расширение ас сортимента сред-, пригодных для опре деления зараженности полевой почвы грибами F.oxysporum и F.solani,дифференцирующих эти виды и подавля ющих сапрофитную no4BeHHSTo микрофло Предлагается среда для определения зараженности почвы Fusarium oxy um и Fusarium solani, которая сожит, вес. %: Азотнокислый 0,15-0,20 натрий Двузамещенный йф ос рн ок и с л ый 0,10-0,15 Хлористый ка0,03-0,05 лий Сернокислый 0,03-0,05 магний Сернокислое же0,001-0,002 лезо закисное 1,5 - 2,0 Галактоза 1,5-2,0 Пентахлорнит0,05-0,1 робе№зол 0,03-0,05 Стрептомицин Желчь медицин12-16МЛ/Л среды Остальное. Из состава исключен дрожжевой экакт, способствующий обильному роспосторонних почвенных грибов и. терий, исключено также подкислесреды фосфорной кислотой. Для шей дифференциации видов Fusarium арозу заменяют в среде на галактозу и концентрацию ее уменьшают с 3 до 1,5-2 %, В качестве веществ, угнетающих рост других грибов ,исполЬ зуют пентахлорнитробензол, который полностью подавляет рост Mucor, Rhizopus, Penicillimn, присутствующих в почве в значительном количестве , а также медицинская желчь для ограничения роста колоний грибов, что облегчает их подсчет на предлага&4Ofi среде.

Технология приготовления среды.

Готовят среду следующего состава: NaNOj, К2НРО, КСг, MgSO, ГеЗОд, галактоза, агар, автоклавируют 20-30 мин при 1 атм. В охлажденную до 45-47 С среду перед разливкой в чашки Петри добавляют пентахлорнитробензол, стрептомицин и медицинскую желчь. Навеску почвы (в пересчете на 10 г воздушно-сухой почвы) вносят в колбу с 90 мл стерильной воды, тщательно взбалтывают и приготовляют последовательные разведения до 1:1000, Затем 1 мл почвенной суспензии в разведении 1:1000 высевают глубинным способом на рекомендуемую среду (по 20 чашек Петри на калщый почвенный образец) . Засеянные чашки инкубируют сут. при 25-27 с на рассеянном свету, что сгйэсобствует лучшей пигментации гриба. Затем подсчитывают количество колоний грибов каждого вида и пересчитывают их на 1 г воздушнО-сухой почвы: Колонии Fusariun oxyspprumV на д анной среде пушисто-пленчатые, имеют характерную телесно-розовую окраску; F.s olani образуют пышный ватообразный миЦ| лий беловато-кремового цвета.

Пример 1.Определение количесва инфекций F.oxysponim и F.solani в почве проводят с помощью среды сле дующего состава, вес, %:

NaNOg.- 0,15

KjHpdx0,10

KCZ0,03

,001

MgSOi0,03

Гсшактоза1 5

Аг ар1,5

ВодаОстальное,

Среду стерилизуют 20 мин при 1 a-TMf после охлаждения до нее добавляют пентахлорнитробензол О,,05 стрептомицин0,03%, желчь медицинскую 12 мл/л среды. Затем в 20 чашек Петри производят глубинный посев 1 м почвенной суспензий в разведении IslOOO и заливают средой. После 7 су инкубации при иа среде fi чашках Петри хорошо различимы колонии F.oxyporum и F.solani, Подсчитывают количество колоний каждого вида в 20 чашках и пересчитывают на 1 г воздушносухой почвы. Для этого определяют среднее количество колоний кгикдогс вида в одной чашке и умножают на разведение (1000) .

Пример 2.Для определения зараженности полевой почвы видами F.oxysporum и F..soiani используют среду следующего состава, вес,%:

NaNOj 0,17

KjHP040,12

KCtО.,04

,04

,001Галактоза1,7

ВодаОстальное.

После 25 мин стерилизации среды при 1 атм ее охлаждают до 47°С и добавляют пентахлорнитробензол 0,07%, стре.птомицин 0,04% и желчь медицинскую 14 мл/л среды. Затем производят посев почвенной суспензии по описанной выше методике.После 8 сут; инкубации засеянных чашек на рассеянном свету при 27с проврдят под0 счет колоний каждого вида гриба и пересчитывают их количество на 1 г воздушно-сухой почвы.

Пример 3.Количественное определение запаса почвенной инфекции 5 F.oxysporum и F.solani проводят на среде следующего состава, вес. %: ,20

КлНР040,15

КС Z0,05

QMgSO4-7Hj,O0,001

.Пентахлорнитробензол 0,1 Стгдаптомидин 0,05 Желчь меди-цинская 16 мл/л

FeS040,002

Галактоза2,0

Агар2,0

ВодаОстальное.

Среду стерилизуют при 1 атм 0 30 мин и после охлаждения ее до вводят пентахлорнитробензол, стрептомйции и медицинскую желчь в указанных концентрациях. Посев проводят по описанной ранее методике; пос5 ле iO сут. инкубации чашек при на рассеянном свету подсчитьшают колонии F.oxysporum и F.soiani и пересчичъшают на 1 г воздушно-сухой почвы,

nАнализ почвенного образца, проведенный на описанных трех вариантах предлагаемой среды, дает идентичные результаты.

Формула изобретения

Среда для определения зараженности почвы Fusarixam oxysporum Schl. и Fu - sarlvira soiani App.et.Wr.,включающая Азотнокислый натрий,двуз мещенный фсхзфорнскислый калий, сернокислый магний, хлористый калий, сернокислое железо, закисноё, стрептотцин, ,агар и воду, о т л и у а ю ща я - я тем, что, с целью подавления сапрофитной почвенной микрофлоры и дифференциации видов Fusarixim, она дополнительно содеркит пентахлорнитробенэол, медицинскую желчь и галактозу, причем компоненты содержатся в среде в следующем соотношении, вес. %: Азотнокислый

0,15-0,20

натрий

Двузамещен-,

ный фосфорно0,10-0,15 кислый калий Хлористый 0,03-0,05 калий

Сернокислый 0,03-0,05 магний Закиснов сернокислое

0,001-0,002 железо

Галактоза

,0

Агар 1,5-2,0

Пентахлор0,05-0,1

нитробензол 0,03-0,05

Стрептомицин

елчь меди-12-16 мл/л среды

цинская

Вода Остальное.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1.Руководство по изучению п 5чвенных микроорганизмов и их метаболитов. Под редакцией Н.А. Красильникова, Изд-во МГУ, 1966, с. 11-20.

2.Buxton Е. Rendrick. А mettod of Isolating Phytium spp. and Fusa5rium oxysporum from Soil. Ann.Appl. Biol. 1963,V.51.p.221-215 (прототип),