ШТАММ АКТИНОМИЦЕТА Streptomyces lateritius 19/97-M, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ СТИМУЛИРОВАНИЯ РОСТА И ЗАЩИТЫ СЕЯНЦЕВ ХВОЙНЫХ ОТ ВОЗБУДИТЕЛЕЙ БОЛЕЗНЕЙ, ВЫЗЫВАЕМЫХ ГРИБАМИ РОДОВ Fusarium И Alternaria Российский патент 2005 года по МПК C12N1/20 A01N63/00 C12N1/20 C12R1/465 

Изобретение относится к области микробиологии, касается нового штамма актиномицета Streptomyces lateritius 19/97-М и может быть использовано для стимулирования роста и защиты сеянцев от возбудителей сосудистых микозов, вызываемых грибами родов Fusarium и Alternaria.

В практике защиты растений используются грибы рода Trichoderma [1;2]. Актиномицеты, образующие антибиотические вещества, рекомендованы только для защиты сельскохозяйственных растений [3;4] и редко используются в практике защиты сеянцев древесных пород [5]. Отсутствие работ по подбору штаммов и применению этой группы микроорганизмов для защиты сеянцев древесных пород сдерживает их возможности при получении здорового лесопосадочного материала.

Учреждениями-разработчиками: АН УзССР и Институтом микробиологии и вирусологии АН Каз.ССР рекомендованы соответственно штаммы-продуценты Actinomyces netropsis 1592 и 2129 и Streptomyces griseoruber 3-79 №314, обладающие широким спектром активности к возбудителям болезней овощных культур [3;4].

В настоящее время микробиологической промышленностью не освоено производство биологических препаратов на основе активных штаммов актиномицетов для защиты сеянцев от возбудителей сосудистых микозов.

Техническим результатом изобретения является штамм актиномицета Streptomyces lateritius 19/97-М ВКПМ Ас-1637, обладающий высокой антагонистической активностью в отношении фитопатогенных микромицетов родов Fusarium и Alternaria - возбудителей сосудистого полегания и стимулирующий рост сеянцев хвойных.

Технический результат достигается использованием штамма актиномицета Streptomyces lateritius 19/97-М ВКПМ Ас-1637 для стимулирования роста и защиты сеянцев хвойных от возбудителей сосудистых микозов. Особенностью штамма является высокая конкурентоспособность и скорость роста. Для рекомендуемого штамма характерно быстрое накопление биомассы и высокая репродуктивная способность.

Предлагается применение этого штамма в качестве биопродуцента для создания на его основе экологически безопасных биопрепаратов.

Штамм выделен из почвы лесопитомника (56°04^/ с. ш.; 92°42^/ в. д.) Красноярского края в 1997 г.

Штамм характеризуется следующими признаками.

Морфологические признаки: на твердой питательной среде крахмалоаммиачный агар (КАА) образует обильно разветвленный мицелий, частично распадающийся на фрагменты. Вегетативные гифы диаметром 0.5-2.0 мкм (фиг.1). Воздушный мицелий в зрелом состоянии несет цепочки из трех-четырех неподвижных спор. При росте на плотных питательных средах образует относительно медленно растущие колонии, которые достигают 2-4 мм в диаметре на 5-7 сутки (при 27±2 °С). Колонии плотные, кожистые, неправильно округлой формы, бархатистый налет на их поверхности появляется на 12-14 сутки культивирования. На глицериннитратном агаре цвет колоний варьирует от красного до темно-бордового (фиг.2). Рост на жидких питательных средах сопровождается образованием розово-красных глобул диаметром 2-3 мм. Окраска по Граму положительная, аэроб, хемоорганотроф.

Культуральные признаки: при культивировании на плотной питательной среде (овсяный агар) в течение 7 суток при 27±2° С штамм продуцирует 3900 ± 200 колониеобразующих элементов с площади 100 мм² (1 см²). При глубинном культивировании на крахмалоаммиачной среде в течение 7 суток штамм продуцирует 2.5 г/л биомассы. При поверхностном культивировании на крахмалоаммиачной среде при 25°С продуктивность штамма составляет 1.13±0.326 г/л на 7-е сутки, 1.75±0.118 г/л - на 14 - е сутки и 2.08±0.15 г / л на 21-е сутки культивирования; прирост биомассы штамма составляет 0.15±0.05 г/л/сут через 7 суток, 0.12±0.01 г/л/сут через 14 суток, 0.10±0.01 г/л/сут через 21 сутки.

Крахмалоаммиачная среда, г/л: (NH₄)₂SO₄ - 1; К₂HPO₄ - 1; NaCl - 1; MgSO₄ - 1; крахмал - 1, агар-агар - 15, водопроводная вода - 1000.

По заключению специалистов Красноярской краевой ветеринарной лаборатории данный штамм авирулентен, нетоксичен, нетоксигенен в отношении теплокровных организмов и не вызывает инфекционных заболеваний.

На фиг.1-5 представлены следующие иллюстрации:

Фиг.1. Морфология клеток штамма Streptomyces lateritius 19/97- М на крахмалоаммиачном агаре.

Фиг.2. Морфология колоний штамма Streptomyces lateritius 19/97- М на глицериннитратном агаре.

Фиг.3. Угнетение роста Fusarium lateritium (А) и Fusarium avenaceum (Б) метаболитами Streptomyces lateritius штамм 19/97-М.

Фиг 4. Антагонистическая активность Streptomyces lateritius штамм 19/97-М.

1 - Fusarium moniliforme, 2 - F.avenaceum, 3 - F.oxysporum, 4 - F.solani, 5 - F.nivale, 6 - F.gibbosum, 1 - F.semitectum, 8 - F.sambucinum, 9 -F.sporotrichioides, 10 - F.heterosporum, 11 - F.lateritium, 12 - F.chlamydosporum, 13 - Alternaria alternata.

Фиг.5. Стимулирование роста сеянцев Larix sibirica L. на 10 сутки 1 - контроль; 2 - обработка Streptomyces lateritius штамм 19/97-М.

Реализация использования Streptomyces lateritius штамма 19/97-М как продуцента биопрепарата для стимулирования роста и защиты сеянцев хвойных от полегания.

Пример 1. Технология глубинного периодического культивирования включает несколько этапов:

Посев Streptomyces lateritius штамм 19/97-М производят культурой из расчета 1,5-2×10⁶ пропагул на 1 мл питательной среды. В качестве посевного материала используют культуру штамма, выращенную на скошенном крахмалоаммиачном агаре. Из пробирок делают смыв в колбы со стерильной водой, затем определяют титр пропагул в полученной суспензии методом Брида и методом пересчета на весь объем питательной среды используют необходимое количество суспензии для засева. Засев производят в колбы Эрленмейера объемом на 250 мл на 100 мл питательной среды. Для максимального спороношения выращивание производят в течение 7 суток на жидкой крахмалоаммиачной среде следующего состава: (NH₄)₂SO₄ - 1; К₂HPO₄ - 1; NaCl - 1; MgSO₄ - 1; крахмал - 1, водопроводная вода - 1000.

После окончания культивирования биомассу отделяют от питательной среды, высушивают до постоянного веса и измельчают на гомогенизаторе; при такой форме биопрепарата отсутствует питательная среда, на которой выращивали актиномицет.

Полученный биопрепарат представляет собой сухой порошок светло-серого цвета с титром пропагул 5,5-6×10¹² пропагул/г.

Пример 2. Культуру Streptomyces lateritius штамм 19/97-М с твердой среды засевают в жидкую крахмалоаммиачную питательную среду и культивируют при 27±2°С. Через 7 суток культивирования отбирают пробы культуральной жидкости, которые фильтруют через мембранные фильтры с диаметром пор не более 0,5-1 мкм. Затем культуральной жидкостью смачивают стерильные бумажные диски диаметром 5 мм. Высушенные диски раскладывают на питательную среду в чашках Петри, предварительно засеянную "газоном" тест-организмов: Fusarium moniliforme, F.avenaceum, F.oxysporum, F.solani, F.nivale, F.gibbosum, F.semitectum, F.sambucinum, F.sporotrichioides, F.heterosporum, F.lateritium, F.chlamydosporum, Alternaria alternata. Чашки инкубируют в термостате при 27±2°С в течение 5-7 суток. Контролем служат бумажные диски, смоченные стерильной водой.

Отсутствие роста тест-организма вокруг бумажного диска свидетельствует о наличии антибиотических свойств у актиномицета Streptomyces lateritius штамм 19/97-М (фиг.3). По оси ординат откладывают зону отсутствия роста тест-организма в мм. Так, все исследуемые возбудители сосудистых микозов сеянцев хвойных обладали средней и высокой чувствительностью к действию метаболитов штамма (фиг.4).

Пример 3. Посев Streptomyces lateritius штамм 19/97-М производят культурой из расчета 1,5-2×10⁶ пропагул на 1 мл питательной среды. В качестве посевного материала используют культуру штамма, выращенную на скошенном крахмалоаммиачном агаре. Из пробирок делают смыв в колбы со стерильной водой, затем определяют титр пропагул в полученной суспензии методом Брида и методом пересчета на весь объем питательной среды используют необходимое количество суспензии для засева. Засев производят в колбы Эрленмейера объемом на 250 мл на 100 мл питательной среды. Для максимального спороношения выращивание производят в течение 7 суток на жидкой крахмалоаммиачной среде следующего состава: (NH₄)₂SO₄ - 1; К₂HPO₄ - 1; NaCl - 1; MgSO₄ - 1; крахмал - 1, водопроводная вода - 1000.

После окончания культивирования биомассу отделяют от питательной среды, высушивают до постоянного веса и измельчают на гомогенизаторе; при такой форме биопрепарата отсутствует питательная среда, на которой выращивали актиномицет. Посевы Larix sibirica L., Pinus sylvestris L., Picea obovata L. обрабатывают суспензией штамма, содержащей 10 мг биомассы на 1 мл из расчета 10 мл на 100 семян. Сеянцы выращивают в лабораторных условиях при непрерывном освещении 32 ФАР в керамзите в течение 21 суток вегетации. Проводят оценку энергии прорастания семян на 7-е сутки вегетации, всхожести семян на 21 сутки вегетации.

Увеличение энергии прорастания и всхожести семян свидетельствует о выделении штаммом метаболитов, стимулирующих ростовые процессы у сеянцев Larix sibirica L. (фиг.5), Pinus sylvestris L., Picea obovata L. (таблица).

Таким образом, штамм Streptomyces lateritius 19/97-М может быть использован в качестве продуцента биопрепарата для биологического контроля возбудителей сосудистых микозов из родов Fusarium и Alternaria и стимулирования роста сеянцев хвойных.

Источники информации

1. Третьяков А.П. Щербаков Г.Я., Стирманова Н.И. Штамм микромицета Trichoderma lignorum для производства препарата против фитопатогенных грибов: Пат. 2034468 Россия, МКИ⁶ A 01 N 63104, C 12 N 1/14 - №93028450/13. Заявл. 21.06.93, опубл.10.05.1995. Бюл.№13.

2. Громовых Т.И., Шмарловская С.В., Тюльпанова В.А., Громовых B.C. Штамм гриба Trichoderma sp. МГ-97, используемый для защиты сеянцев хвойных от фузариозов. Патент на изобретение №2171580. M.10.08.2001, - 12 с.

3. Аскарова С. Актиномицеты-антагонисты фитопатогенных микроорганизмов и их роль в устойчивости хлопчатника к вертициллезному вилту. Автореф.дисс.... докт. биол.наук, Ташкент, 1970, - 45 с.

4. Тулемисова К.А. Игина Е.Ф., Никитина Е.Т. Штамм Streptomyces griseoruber 3-79 №314 продуцент антибиотика для борьбы со слизистым бактериозом капусты / Авт. свид. СССР №1042.349. - Ин-т микробиологии и вирус. АН Каз.ССР. 16.05.1983, - 8 с.

5. Dumroese R.K., James R.L., Wenny D.L. Interaction among Streptomyces griseoviridis, Fusarium root disease, and Douglas-fir seedlings // New Forest, 1998. - 15. - P.181-191.

Изобретение относится к области микробиологии и может быть использовано для стимулирования роста и защиты сеянцев хвойных от возбудителей болезней, вызываемых грибами родов Fusarium и Alternaria. Штамм актиномицета Streptomyces lateritius 19/97-М выделен из почвы лесопитомника (56°04′ с.ш.; 92°42′в.д.)Красноярского края в 1997 г. и депонирован во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов, ФГУПГосНИИгенетикаи и имеет номер ВКПМ Ас-1637. Штамм актиномицета Streptomyces lateritius 19/97-М ВКПМ Ас-1637 используют для стимулирования роста и защиты сеянцев хвойных от возбудителей сосудистых микозов. Особенностью штамма является высокая конкурентоспособность и скорость роста. Изобретение обеспечивает быстрое накопление биомассы и высокую репродуктивную способность. 5 ил., 1 табл.

Штамм актиномицета Streptomyces lateritius ВКПМ Ac-1637, используемый для стимулирования роста и защиты сеянцев хвойных от возбудителей болезней, вызываемых грибами родов Fusarium и Alternaria.