Способ приготовления объектов для их исследования в электронном микроскопе Советский патент 1980 года по МПК G01N1/42 

1

Изобретение относится к области электронномикроскопических исследований и может быть использовано при анализе структуры клеток, выделенных клеточных органелл, клеточных 5 мембран, жидких кристаллов и органических макромолекул.

Известен способ приготовления срезов, применяемый в электронной Шмикроскопии, включающий дегидратацию путем последовательного замещения воды на этиловый спирт или ацетон в фиксированных денатурирующими агентами объектах, пропитку в зали- вочной среде,полимеризацию и ультратонкую резку,связанный с изменением ультраструктуры объектй в процессе замены воды на этиловый спирт 1 .,

Наиболее близким по технической сущности и. достигаемому эффекту к предложенному является способ приготовления объектов для их исследования в электронном микроскопе, включающий 25 быстрое замораживание до температуры жидкого азота, возгонку воды в охлажденной вакуумной камере, пропитку в заливочной среде, полимеризацию и резку на ультрамикротоме 2 . 30

Недостатком этих способов является невозможность выявления неизменных структурных элементов, невозможность улучшения пропитки объекта, фиксации лиофилизированного объекта и улучшения качества микроскопического изобралсения.

Цель изобретения - устранение указанных недостатков.

Это достигается тем, что перед пропиткой .в заливочной среде объект помещают в низкомолекулярную гидрофобную среду с последующим постепенным замещением ее заливочной средой, причем в качестве низкомолекулярной среды применяют раствор четырехокиси осмия в низкомолекулярной гидрофобной среде.

Применение быстрого замораживания с последующей лиофилизацией при низкой температуре позволяет сохранить ультраструктуру объекта, так как при используемых скоростях замораживания не образуются кристаллы воды, нарушающие ультраструктуру, а сублимация витри(}«цированной воды при низких температурах позволяет избежать рекристаллизации.

. Выдержка лиофилизированного объекта в низкомолекулярной гидрофобной

среде, смешанной с высокомолекулярной заливочной средой, с постепенным полным замещением первой на последнюю приводит к качественной пропитке объекта, что дает возможность после полимеризации выявит на срезах структурные элементы объекта в неизменном виде. Кроме того, применение раствора четырехокиси осмия в низкомо лекулярной гидрофобной среде приводи к фиксации объекта и улучшению качества электронномикроскопического изображения.

Пример. Приготовление срезов

Быстро изолированный из организма исследуемый объект погружался во ф1)еон-12, охлажденный жидким азотом. Иэ фреона объект переносился в жидки аэот, где хранился до его помещения .в охлажденную до заданной температуры камеру вакуумной установки.Далее производилась сублимация витрифицированной воды из объекта. После полной, возгонки воды, извлеченной из вакуумной камеры, объект быстро погружался в четыреххлористый углерод. Пр необходимости фиксации объекта в четыреххлористом углероде растворялась четырехокись осмия. После отмывки от несвязанной четырехокИёи осмия четыреххлористым углеродом объект переносился в смесь четыреххлористого углерода с заливочной средой(аралдит), концентрация которой постепенно повышалась до 100%. Далее осуществлялась полимеризация при температуре 60°С, резка на ультрамикротоме КВ-8800 и просмотр в электронном микроскопе ЕМ-7. Температура жидкого фреона составляла -158°С. Рабочий вакуум камеры для высушивания объект был 10 мм рт.ст. Температура камеры составляла от -20 до . Концентрация четырехокиси осмия в четыреххлористом углероде 20%. Объект переносился в заливочную среду из четыреххлористого углерода по следующей схеме: 6 частей четыреххлористого углерода на 1 часть заливочной среды, т.е. .6:1, затем 4:1, 2:1, 1:3 1:6, чистая заливочная среда. В каждои смеси объект вьадерживался в течение 2 ч.

Использование предлагаемого способа позволяет сохранить основные компоненты в неизменном виде, улучшить пропитку лиофилизированного материала/что создает условия для его нормальной ультратонкой резки при изготовлении объектов для исследования в электронном микроскопе, а также при.-- структурных анализах клеток, выделенных клеточных органелл, исследye шx мембран,жидких кристаллов и органических макромолекул.

Формула изобретения

1.Способ приготовления объектов для их исследования в электронном микроскопе, включающий быстрое замораживание до температуры жидкого азота, возгонку витрифицированной воды

в охлажденной вакуумной камере, пропитку в заливочной среде, полимериза цию и резку на ультрамикротоме, отличающийся тем, что, с цель выявления неизменных структурных элементов и улучшения пропитки o6bekTa, перед пропиткой в заливочной среде его помещают в низкомолекулярную гидрофобную среду с последующим постепенным замещением ее заливочной средой.

2.Способ по п. 1, отличающий с я тем, что, с целью фиксации лиофилизированного объекта и улучшения качества микроскопического изображения, в качестве низкомолекулярной среды применяют раствор четырехокиси осмия в низкотемпературной гидрофобной среде.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1.Sjosbrand F. S. Electron MicroscopL| of Cells and Tissues, voI.l,N V,London, 1967, p. 188-219.

2.Brown and Bertke, Textbook of Cytology, The C.V. Mosby Company, 1969, p. 15-19.