Способ определения кислотности фагоцитов Советский патент 1984 года по МПК G01N33/48 A61B10/00 

О5/

00 Изобретение относится к биохимии и может быть использовано в медицин ской цитохимии для исследовакия пат логии клеток. Известен способ определения кислотности фагоцитов путем флуоресцен ной спектроскопии, основанньй на том, что спектр возбуждения флуорес цина изоглиоцианата является чувствительньм к рН среды С1 3. Однако чувствительным участком данного способа является рН от 5 до 7, тогда как за этими пределами способ нечувствителен. Известен также способ: определени кислотности фагоцитов путем смешива ния их с фагоцитируемыми частицами, последующей инкубации смеси и добав ления реагента для определения рН, среды С 2 3. Однако при известном способе используются индикаторные красители, такие, как нейнтральный красный, бромкрезоловый фиолетовый, бромкре.золовый зеленьй, бромфеноловьй сини которые имеют интервал перехода окраски 2 ед, рН, В этих пределах про исходит плавный переход окраски чере все цветовые оттенки, визуально труд но отличимые друг от друга. Все это делает точность измерения рН с испол зованием перечисленных индикаторов равной половине интервала перехода окраски красителя, а именно 1 ел, рН Цель изобретения - повышение точности способа при определении функциональной активности клетки. Указанная цель достигается тем, что согласно способу определения кислотности фагоцитов путем смешивания их с фагоцитируемьми частицами с Последующей инкубацией смеси и определением рН среды с помощью индика тора, в качестве индикатора используют 125-175 мкМ сернокислой меди и 20-30 мкМ ферроцианида калия, затем в ряд инкубационных смесей добав ляют цитрат натрия от 2 мкМ до образования ферроцианида меди в исследуе мой пробе, а кислотность фагоцитов (У) определяют по формуле У 5,212,, где X - концентрация цитрата натрия в пробе с образовавшимся ферроцианидом меди, мкМ, Образование ферроцианида меди определяют электронномикроскопически. Способ осуществляют следующим . образом. Кислотность определяют по образованию осадка в реакции между Си и СГе CCN)(, , которые в нейтральном растворе ойразуют осадок ферроцианида меди rFe(CN)4 %Cu2 Fe(CN). Добавляя предварительно в раствор различные количества хелатообразующего агента - цитрата, можно вызывать формирование осадка ферроцианида меди при строго определенных значениях рН в пределах от 3,00 до 5,00 и на основании этого построить калибровочнук кривую, Состав опытных смесей для построения калибровочной кривой: среда 199, различные количества цитрата натрия, соответствующие количества хлорида натрия, 125-175 мкМ сернокислой меди, 20-30 мкМ ферроцианида калия. Количество цитрата натрия, вводимое в опытные смеси, варьирует от 2 до 35000 мкМ, определяется по формуле У 5,212-}Г° где X - концентрация цитрата натрия, мкМ, У - значение рН, и зависит от определяемой величины рН, Нижние значения цитрата .натрия обусловлены максимально возможной точностью дозаторов, превышение верхнего предела значений цитрата натрия приводит к нарушению условий изотоничности опытных смесей. Концентрационные значения всех других реагентов находятся в зависимости от концентрации цитрата натрия, изменение их в любую сторону от указанных пределов ведет к нарушению закономерности протекания реакции. Кислотность фагоцитов определяют внесением их с фагоцитируемым материалом в опытные смеси и электронномикроскопически регистрируют в клетках образование осадка, ферроцианида меди. Пример 1, Построение кривой формирования ферроцианида меди при рН 3,00-5,00 в зависимости от концентрации цитрата натрия (см, табл.). Исходный рН растворов 7,2,, рН растворов изменяют добавлением 0,4 н. НС1 под контролем рН-метра (рН - 340). Светопоглощение оценивают на спектрофотометре СФ-26 при 565 нм. В результате проведенных исследований получена кривая образования осадка ферроцианида меди при опрееленных значениях рН в зависимости т концентрации цитрата натрия. Уравнекие регрессии, рассчитанное методом наименьших квадратов, имеет следующий вид: У 5,21 2 Х°, где X - концентрация цитрата натрия, мкМ У - значения рН. Коэффициент корреляции равен г 0,996 (р :0,001). , Полученная кривая использована при изучении рН в фагоцитируемьк вакуолях клеток в системе in vitro. Фагоциты получают промыванием брюшной полости мьшей СВА раствором ХеНкса: на 250 мл - 500 мг бычь го сывороточного альбумина и 5000 ед гепарина. Клетки осаждают центрифугированием в течение 8 мин при 1200 об/мин на холоде. После этого осадок ресуспендируют в растворе Хенкса с 0,2%-ным бычьим сьшороточн альбумином и вновь центрифугируют при тех же режимах. Клетки ресуспен дируют в среде 199 и инкубируют в опытньк смесях (1-7). Время инкуб ции составляет 60 мин на водяной бане при и постоянном встряхивании (амплитуда - 4, частота - 1 Universal shakertyre 327). В качест ве фагоцитируемого материала исполь зуют частицы латекса. Количество клеток в инкубационной среде 1 х X . После инкубации клетки осаждают центрифугированием (3000 об/мин в течение 5 мин) и готовят стандартно для электронномикроскопических исследований. Для этого полученные осадки фиксируют в 4%-ном растворе пapaфopмaльдeги a на растворе Хенк- са в течение 3 ч, постфиксирутот . 1%-ным pacTBOpoiM четырехокиси осмия в течение 3 ч, обезвоживают в возра тающем ряду ацетона (от 70 до 100%) заливают в смесь эпон-аралдит, полимеризуют в течение 48 ч. Ультратонкие срезы получают на ультрамикротомах , фирм LKB (Швеция) и Sorvall (США). Материал просматривают в электронных микроскопах при ускоряющем напряже- . НИИ 60-80 кВ. Пример 2. Все продукты полностью соответствуют процедурам, описанным в примере 1, за тем лишь исключением, что в качестве фагоцитируемого материала вместо частиц латекса используют опсонизированный зимозан. В фагосомах макрофагов, содержащих

частицы латекса или зимозана, которые инкубировались в опытных смесях, формирующих ферроцианид меди при рН

ся. При таких условиях никаких электронноплотных осадков в клетках не наблюдают. 4,50-3,75, наблюдают электронноплотные осадки. Тогда как в микрофагах, инкубированных в смесях, дающих осадок при рН 3,50-3,00 электронноплотных осадков не найдено. Таким образом, используя предлагаемьй способ, установили, что нижний закисления рН в фагоцитируемых вакуолях макрофагов колеблется между 3,50 и 3,75. Найдено также образование электронноплотных осадков не только в полностью сформировавшихся фагосомах с поглощенными частицами, но и в местах контакта фагоцитируемого материала (зимозан) с плазматической мембраной макрофагов. Глубина закисле-. ния в местах контакта также находится в пределах рН 3,50-3,75. Предлагаемый способ позволяет регистрировать электронноплотные осадки без дополнительного контрастирования ультратонких; срезов. Однако, при необходимости 5 онтрастирования можно использовать только уранилацетат, но не цитрат свинца, так как его раствор вызывает растворение осадка ферроцианида меди. Для доказательства того, что электронноплотные оса,цки формируются именно в результате изменения рН, а не из-за усиленной генерации супероксидных радикалов, бьша поставлена контрольная реакция. В отсутствии клеток бьша проверена опытная смесь в системе квантиноксидазы, продуцирующей суперксидные радикалы и имитирующей тем самым ангшогичное функционирование фагоцитирующих клеток. Даже заведомо больший уровень суперксидных радикалов, чем в извест ных биологических системах, не вызывает образования осадка ферроцианида меди в исследуемой опытной смеси. Проведена контрольная реакций п.ри и в присутствии 0,2%-ного. раствора азида натрия для доказательства того, что наблюдаемые электронноплотные осадки представляют собой результат функционирования фагоцитирующих клеток и их ферментных систем. Эти условия не препятствуют только прилипанию фагоцитируемого объекта к клетке, большинство же протекающих биохимических процессов ингибируютИз результатов двух проведенных КОНТРОЛЬНЫХ реакций видно, что элект роиноплотный осадок ферроцианида меди формируется именно при кислых значениях рН, которые являются результатом функциональной активности клеток.

Приведенные примеры свидетельствуют о том, что предлагаемым способом можно определить рН субклеточных структур, получаека 1е данные имеют высокую точность (определение рН колеблется в пределах 0,25, в то время как при способе световой микроскопии этот предел соста яет 1,0).

В связи с тем, что исчезает необходимость химически связывать с фагоцитируемым объектом соединения, вступаю1цие в реакцию при кислых значениях рН, появляется возможность использовать в качестве фагоцитируемого материала значительно большее количество инициаторов фагоцитоза. При известных способах таким материалом служат только дрожжевые клетки.

Изучаемые предлагаемым способом свойства определяют бактерицидное действие фагоцитируквцих клеток на потогенные микроорганизмы, осуществление антиопухолевогоконтроля в организмах и т.д. Способ применим как для изучения механизмов, происходящих в клетках, так и возможных патологических отклонений от нормы.

СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ КИСЛОТНОСТИ ФАГОЦИТОВ путем смешивания их с фагоцитируемыми частицами с поспедукидей инкубацией смеси, определением рН среды с помощью индикатора/ отлич ающийся тем, что, с целью повышения точности способа, в качестве индикатора используют 125-175 мкМ сернокислой меди и 20-30 мкМ ферроцианида калия, затем в ряд инкубационных смесей добавляют цитрат натрия от 2 мкМ до образования ферроцианида меди в исследуемой пробе, а кислотность фагоцитов (У) определяют по формуле У 5,212.Х-°° , где X - концентрация цитрата натрия в пробе с образовавшимся ферроциан;вдом меди, мкМ.