Способ получения глюкозоизомеразы Советский патент 1980 года по МПК C12D13/10 

(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ГЛЮКОЗОИЗОМЕРАЗЫ

1

Изобретение относится к способам микробиологического получения ферментов изомеризации глюкозы и может быть использовано в пищевой промышленности для конверсии глюкозы в фруктозу, в частности при производстве фруктозных сиропов из кукурузного крахмала.

Изомеразу глюкозы, применяемую для такой конверсии, получают из микроорганизмов, относящихся к различным родам, включая Arthrobacter; Streptomyces, Bacillus и Actinophanes.

Наиболее близким к изобретению по технической сущности является способ l, согласно которому в качестве продуцентов глюкозоизомеразы используют микpoopгaниз 1ы вида FTarobacterium devorans.

Недостатком известного способа является невысокий уровень активности штаммов , продуцирующих фермент.

Целью изобретения является повышение ферментативной активности.

Поставленная цель достигается . тем, что в качестве пpoдsщeнтa глюкозоизомеразы используют штамли F1avobacteгiurn аrborescens АТСС 4358

или Flayobactertun arborescens NRRL В-11622, илигТауоЬасТегГит aгbo: rescens NRRL В-11023.

Указанные культуры хранятся в 5 Американской коллекции типовых культур под номером АТСС 4356 и в Коллекции культур ARS Северной региональной исследовательской лаборатории Министерства земледелия ОНА в Паории, 10 штат Иллинойс, под NRRL В-11022 и NRRL В-11023.

Все три штамма продуцентов характеризуются сходными морфологическими/ культуральными и физиологичес15 ними -признаками.

Палочки размером 0,5x2,5 мкм, одиночные и в цепочках, неподвижные, грамположительные, на стандартных питательных средах образуют длинные, 20 волйистые нити.

На желатиновой среде колонии сначала нитевидные и ветвистые, затем центр становится желтоватым, а край - полупрозрачным и древовидным. 25 Желатиновый столбик разжижается,

плавится с образованием желтого осадка.

На жидком бульоне рост бактерий в виде суспензии с желтым осадком, 30 без тонкой пленки. Молоко коагулирут без подкисления. На картофеле ост интенсивный в виде оранжевой лёнки. Нитраты не усваивают, нитриы не образуют. Аэробы или факульативные анаэробы.

Оптимальная температура . В дополнение к указанному выше F. arbbrescens АТСС 4358 хар ктаризуется способностью к интенсивному синтезу фермента при культяви ВваНИИ на питательной среде, содержащей ксилозу в качестве единственного углевода, на глюкозе или лактозе активность фермента низкая. Штамм F, arborescens NRRL В-11022 проявляет значительную изомеризующую активность при культивировании на питательной среде с лактозой и малую активность на среде с глюкозой, йтамм F. arborescens NRRL 6-11023 характеризуется высокой изомерйзующей активностью при культивировании на питательной среде, содержащей глюкозу или лактозу.

Описанные микроорганизмы можно выращивдть в различных средах, содержащих источники углерода/ азота и неорганические соли. Типичная среда состоит из гидролизованного животного протеина, кукурузного сока, экстракта пивных дрожжей, дигидрофосфата калия и соответствующего углевода (ксилоза, глюкоза, мальтоза, сахароза и лактоза, гидролизаты ксилана, крахмала и целлюлозы). Начальный рН питательной среды должен равняться приблизительно 7, ферментацию следует проводить в аэробных условиях при температуре приблизительно в подходящем ферментере ищ качалочной колбе. Максимальная : активйость изомёразы достигается через 48-72 ч.

АКТИВНОСТЬ глюкозоизомеразы определяют путём инкубации при в течение 30 мин смеси, состоящей;из О,5 мл содержащего ферМёнт препарата и 1,5 мл раствора, содержащего декстрозу (1,0 М), трициновый буферный раствор (рН 8,01 М) и хлорид магййя (0,03 м). По истечении инкубационного периода реакцию изомеризации Прекращают путем добавления 0,5 мл 1,0 н.раствора соляной кислоты. После центрифугирования всплывающую прозрачную фракцию разбавляют и определяют продуцированную фруктозу. Активнрсть глюкозоизомеразы выражают 4 микроедйницах, одна микроединица ак1 ивности соответствует количеству фермента, необходимого для образования 1 мкг фруктозы в 1 мин при приведенных выше условиях опыта.

Найдено,.что количество изомёразы/ продуцированное предложенными штаммамй при благдп рйятных у(гл6виях культивирования, довольно значительно и гораздо больше, чем колйчество, образуемое другими известными ранее

пpoдs eнтaми изомёразы. Особенно интересным и неожиданным является тот фakт, что максимальное продуцирование изомёразы штаммом NRRL В-11022 достигается в тех случаях, когда в составе питательной среды применяют лактозу. Например, в среде, содержащей 2% лактозы, ферментатийная активность соЬтавила 2892 микроединиц из(1еразы на 1 мл (мкед/мл) ферментационного бульона. Следовательно, штаммы согласно изобретению характеризуются и отличаются от известных ранее микроорганизмов тем, что могут продуцировать значительные количества (500 мкед/мл бульона или более) активной глюкозоизомеразы при культивировании в питательной среде, содержащей лактозу в качестве единственного источника углеводов. Довольно значительное продуцирование фермента происходит при полном отсутствии углеводов в питательной среде. Это иллюстрируется данными, приведенными в табл. 1, полученными при культивировании при 3. штаммов F. arborescens в питательной среде, содержащей (%) 1 гидролизованного животного протеина, 1 кукурузного сока, 1 экстракта пивных дрожжей, 1 моногидрофосфата калия, 0,5 дигидрофосфата калия и 2 углевода.

Глюкозризомераза, продуцированная F. arborescens, проявляет высокую активность в интервале рН 6-10 и в температурном интервале 45-90С. В табл. 2 показано влияние рН, в табл. 3 - температуры на активность изомёразы, ассоциированной с цельными клетками, полученными путем кульТИвйррвания NRRL В-11022 в содержаще лактозу Питательной среде при в течение 72 ч. Затем собранные Клетки были промыты один раз и повторно суспендированы в воде до первоначальной концентрации клеток в фер;мент ационном бульоне. Для определения а.ктивности изомёразы применялась рписаннг1я выше стандартная мётбдйка определения за тем исключением, что при исследовании влиянчя рН изменяли буферный раствор, а при исследовании влияния температуры изменяли температуру. Стабильност изомёразы оценивали путем выдерживания промытых клеток в 0,05 М трициновом буфере, ), содержащем хлорид магния (0,004 М) при разных температурах с последующим периодическим отбором проб для определения активности фермента, результаты приведены в табл. 4. .

Из данных табл. 4 видно, что фермеНт cyщecтвej нp cтjaбилeн в течение по меньшей мере 2б6 Ч при рН 8 и температуре , как установлено путем исследования промытых клеток, содержащи: фермент. Препарат фермента из промытых, клеток характеризуетт ся, кроме того, тем, что, сохраняет по меньшей мере 85% активности при нагревании в течение 20 ч до температуры при рН 8. Изомераза, продуцируемая F.. агЬо rescens, очень эффективна для конвер сии глюкозы в фруктозу, и для такой конверсии могут быть применены различные способы, уже описанные ранее Пример 1. В колбу Эрлеимейе ра емкостью 500 мл поместили 100 мл питательной среды следукндего состава, %; Гидролизованный животный протеин Кукурузный сок Дрожжевой экстрактК2НР04 КН2Р04 Лактоза Указанную среду инокулируют свеже приготовленным посевным материалом бактерий F. arborescens NRRL В-11022 и инкубируют на качалке при 30°С. По истечении 72 ч клетки собирают и промывают. Активность изсмеразы составила 2892 мкед/мл исходного бульона.

Продуцирование глюкрзоизомеразы микроорганизмами

Примечание. Время продуцирования 72 ч. F. arborescens Пример 2, Повторяют опыт, описанный в примере 1, за тем исключением, что в питательной среде лактозу заменяют ксилозой и посевной маTeji Han гсгговят из F, arborescens АТСС 4358. Через 72 ч клетки собирают и промывают. Активность изомеразы составила 546 микроединиц на 1 мл бульона. Пример 3. Повторяют опыт, описанный в примере 1, за тем исключением, что в питательной среде лактозу заменяют глюкозой и посевный материал получают из Г. arborescens NRRL В-11023. По,истечении 64 ч активность изомераэы составляла 580 микроединиц на 1 Мл бульона. Пример 4V Культивируют F. arborescens NRRL В-11022 при в течение 70 ч в ферментере new Bruuswick емкортью 10 л с применением питательно среды, описанной в примере 1. Клетки собирают и иммобилизуют методом флрккуляции, описанным в патенте ( №3821086. Получают агрегат высушенных 5 локкулированных клетйк с активностью йэомеразы 75 микроёданиц; на 1 грамм. . 1р .. Т а б л и ц а 1

на активность изомераэы, F. arborescens NRRL

Активность глюкозоизорнмеразы, мкед/мл

- PIPIS 598

1204

1782

2202

- трицин , 2624 3016

3456

3408

р I Р - натриевая соль 1, 4-пиперазиндиэтансульфоната.

Трицин - N- 2-окси-1,1-бис-(оксиметил)-этил -глицин.

Влияние температуры на активность изомеразы,продуцируемой F. arborescens NRRL В-11022, при рН 8,0

Активность глюкоизо775

1717

. 2776

3500

4400

5104

5960

6592

7088

764617{

Таблица2 В-11022

Таблица 3 меразы, мкед/мл

Стабильность 1ло юразы, продудируемой F. arborescens NRRL В-11022|

Формула изобретения Спороб получения глюкоэоизбмеразы, предусматривающий культивирование продуцирующих фермент микроорганизмов на средах, содержащих :источники углерода, азота и минеральные соли, с последукяцим извлечением фермента, отличающийся тем, что, с целью повышения ферментативной активности, в

Таблица 4 при разных температурах ;

качестве продуцента глюкозоизомеразы используют штаммы F1 a bbacter i urn arborescens АТСС 4358, Или Flavobacterium arboresceus NRRL B-11022, или Flavobacteriurn arboresceus NRRL B-11023.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1. Патент США 3956066, кл. 195/31 F, опублик. 1976.