Штамм аDRовастеRIUм тUмеFасIеNS NRRL в-11394-продуцент глюкозоизомеразы Советский патент 1982 года по МПК C12N9/92 

Изобретение относится к микробиологической, промышленности, ё(. име но к новому йтамму - продуценту глю козоизомеразы, и спользуемому для получения фруктозы. Известны различные штаммы бактерий, Например Aerobacter cloacae 33 способные продуцировать глюкозоизомеразу 1. Цель изобретения - расширение исто ников -продуцентов глюкозоизомеразы. Изобретение представляет собой. штамм Aerobac.ter tumefaciens NRRL В-Ц394-(.коллекция культур Северной Региональной Исследовательской Лаборатории, Пеория, США) - продуцент глюкозоизомеразы. указанный штамм выделен из почвы Характеристика штайма. Культурально-морфологически°е при наки. |;диничные, иногда в парах, палоч ки размером 0,8-2,0 микрона грамотрицательные, не образуют капсул и спор, подвижные перитрихи с 4-6 жгутиками. Колонии на агаризёванной питательной среде (Difco): приподнятые, с четким краем, кремовые, прозрачные, гладкие 0,5-1 мм в диаметре, обильный рост наблюдается на кальциево-глицерофосфатном-маннито-нитратном агаре с образованием коричневого пигмента и ореола. . Биохимические признаки. Растет при 4-39°С на всех простых средах, не нуждаясь в факторах роста.. В качестве источника азота использует или аминокислоты. Оксидаза: положительная. Каталаза: положительная. Восстанавливает нитраты до нитритов. Не гидролизует: Казеин, желатин, целлюлозу, крахмал , агар. ° Образует 3-кетогликозиды. Абсорбирует краситель на магнит-, ном агаре с анилиновым синим. Изменяет цвет молока с Rocella tenctoria в серо-коричне вь1й. ;Потребление, углеводов окислительное. Использует в качестве источника углерода; 0(-«-) глюкозу, L( + ) арабинозу, 0(+)ксилозу, 0(+)треалозу, D(-) рибозу,и(+)-рамнозу, лактозу, целлобйозу, маль.тозу, цитрат, ацетат, , лактат, пропионат, L-аспарагиновую кислоту, L-аспарагин,. L-гистидин, L-аланин, L-аргинин. Вызывает новообразования -в дисках корнях моркови. . Пример. Готовят питатель среду следующего состава: Глюкоза, г/л5 Ксилоза, г/л5 . ,г/л , . 13 . (NN4)504,г/л-2 ,г/л0,4 Ре5047Н2.0-,мг/л10 СаС l.- .мг/л40 MnS04ЗН О.мг/л . 5 ZnSOi- -7Н,,мг/л . 5 .- ,мг/л1 СоС 17- ,мг/л .1 С помоаью NaOH устанавливают рН 7,2 и разливают по 100 мл в 500 мл колбы Эрленмейера. После стерилизации в течение 30 мин при колбы засевают культурой АдгоЬасteriurn tumefaciens NRRL B-11394 из скошенного агара, содержащего ту же самую среду с 2% агаром ( D i f со) и инкубиру ют в течение 24 ч при 30°С с вращательным перемешиванием со скоростью 220 об/мин. Клетки затем собирают центрифугированием и Промывают буфер ным раствором (, 0,1 М, рН-7, содержащим 1 молей СО и 5 молей ) . С одной колбы получают 2 г влажных клеток. Эти клетки снова суспендируют в 20 мл буферного раствора, указанного выше, и клеточную пульпу подвергают дезинтеграфии на фре-нг-прессе. В дезинтеграте, полученном таким образом, определяют ферментную активность: 1 г влажных клеток содержат 560 ферментных единиц. Ферментную активность определяют следующим образом. К реакционной смеси, содержащей 4,5 мл раствора питательной среды (О - глюкоза 3,67 молярная,Мд 5-1(Т молей, СО++10 молей и 0,1 молярный Б деионизированной воде, рН 7,0).добавляют 0,5 мл неочищенно го экстракта. Смесь инкубируют в течение 2 ч на паровой бв,не. при 60°С. Реакцию прерывают охлаждением смеси до 0°С. Оптическое вращение образца ( с. 1я.:;) и образца оригинала (do) измеряют при комнатной температуре на поляриметре Pirkins blmer 141, линия Na (549 нанометров оптический путь кюветы 0,1 дм. Sa единицу SNAnPROGETT J принято количество порции фермента, которая даеТ-1 лг фруктозы за один час в условиях испытания, приведенных вьпи то число единиц фермента на грамм влажных клеток может быть выражено следующей формулой:. Количество единиц-в 1 г влажных «тт« ток--ЙЙЙ 1 П2ОбЫ глюкозы X 10 клеток- - - --5;j- ---- 5 2 в которойotГД.0Ц + 54,16 ФРУкт. ,35 С - концентрация в г глюкозы на мл раствора 0,1 оптический путь, дм. Пример 2. Питательную среду для культивирования готовят, как в примере 1. Из 500 мл питательной среды получают 10,2 г влажных клеток, которые -сусцендируют в 40 мл буферного раствора ( 0,.1 молярный, рН 7) и добавляют, перемешивая при -10°С, к 200 мл ацетона. После 15 мин обработки клетки собирают на бумажном фильтре, промывают ацетоном, собирают и сушат в вакууме при комнатной/температуре. Таким образом, получают 1,9 г сухих клеток. Активность одного -грамма ацетонового порошка,полученного таким образом, составляет 2,200 единиц. Пример 3. Клетки штамма Ад гоЬас ter i urn tumefaciens NRRL B-11394 получают как в примере 1 и обрабатывают ацетоном, как в примере 2. Клетки, обработанные ацетоном, используют для определения процента изомеризации глюкозы в реакционной смеси как функцию времени. Условия испытания следующие: клетки, обработанные ацетоном, 10 Г} Ьбъем питательной среды 1 л} температура протекания реакции 60°С. Питательная среда имеет следующий состав: глюкоза 60 % {вес/объем, 5 миллимолей, 0,1 миллимолей) , 100 миллимолей - рн 7,0. Проценты изомеризации имеют следующие значения. Время,..4 Превращение,% 3 . . - 12,5,. Таким образом, штамм Ад го bacterium tumefaci.ens NRRL В-11394 является новым штаммом, способным продуцировать глюкозоизомеразу. Формула изобретения Штамм Agrobacter1 urn tumefaciens NRRL В-11394 ТколЛекция культур .

Северной Региональной Исследовательской Лаборатории, Пеория, США. - продуцент глюкоэоизомеразы.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1. Авторское свидетельство СССР 534490, кл. -С 12 N 9/92, 1975.