Способ получения глюкозоизомеразы Советский патент 1979 года по МПК C12D13/10 

(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ГЛЮКОЗОИЗОМЕРАЗЫ ре, инкубируют, перемешивая, при температуре от 1Ь до 40°С (предпочтительно при 25-ciO C) и скорости протекания потока воздуха I объем в минуту в течение 1-7 суток. Скорость подачи воздуха можно изменять от 0,3 до 1,5 объема в минуту. Для получения максимального выхода фермента величину рН ферментационной среды поддерживают в интервале между Ь,0 и 8,5 (предпочтительно между 6,4 и 7,5). Максимальная активность изомеразы в этих условиях достигается но прошествии 3-5 суток. После этого отделяют клетки микроорганизмов и иснользуют их как источник фермента. Возможен и другой вариант, когда фермент экстрагируют из клеток. Уровень активности, прибЛИжаюш,ийся к 30 единицам на 1 мл -Оульона культуры, достигается по прошествии 3-х суток, пдиница .активности определяется как то количество фермента, которое может образовать 1 мкмоль фруктозы из глюкозы за 1 мин при температуре в среде, характеризуюш.еИ€я 1,5 М по глюкозе, 0,03 М по фосфатному буферу с величиной рН 7,0, 0,003 М по сульфату магния и 0,0003 М по сульфату двухвалентного кобальта. Уровень активности изомеразы, достигаемый при практическом осуществлении настоящего изобретения, меняется в зависимости от применяемого штамма и используемой для выращивания среды. Уровень активности, составляющий 50 единиц на 1 мл бульона культуры, имеет место нри культивировании культуры Actinoplanes missouriensis NRRL Б-3342 на среде, содержащей жидкость после вымачивания кукурузы. Хорошую активность получают и при культивировании Actinoplanes phillippensis АГСС 12427, Actinoplanes armeniacus АТСС 15676 и Actinoplanes sp. АТСС 23342. Исследование больщого количества видов Actinoplanes показало, что практически все виды этой культуры, их суокультуры, мутанты и разновидности способны продуцировать глюкозоизомеразу и поэтому могут быть пригодны для осуществле.ния олисываемого способа. Такое положение объясняется следующим. Поскольку стенки клеток микроорганизмов вида Actinoplanes содержат ксилозу (преимущественно Д-ксилозу), организм должен быть способным синтезировать пептозу. Единственным метаболическим путем для синтеза Д-ксилозы является изомеризация Д-ксилозы изомеризирующим ферментом Д-ксилозоизомеразой, который также обладает способностью изомеризации глюкозы во фруктозу. Д-Ксилулоза может быть образована из Д-ксилулозо-5-фосфата при воздействии фосфатазы. Последнее соединение, т. е. Д-ксилулозо-5-фосфат, является важным промежуточным соединением при образовании гексозо-монофосфато-пептозы. Ниже дана схема биосинтеза Д-ксилозы р Actinoplanes. Гексозо-монофосфатно-лептозный путь: Глюкоза-д ф-- С02 Д-ксилулозо-5-фосфат Д-ксилулоза Д-ксилоза изомеризациястенки клеток. Поскольку клеточные стенки Actinoplanes содержат Д-ксилозу, иоэтому все они, как можно ожидать, содержат изомеризуюш,ий фермент. Пример. По этому принципу нолучают фермент глюкозоизомеразу путем культивирования микроорганизмов следующих штаммов: Actinoplanes missouriensis NRRL В-3342, Actinoplanes phillippensis АТСС 12427, Actinoplanes armeniacus АТСС 15676 и Actinoplanes sp. АТСС 23342. Эти микроорганизмы хранят по отдельности в форме исходных культур на пластинках с 1,7% триптона, 0,3% сойтона, 0,25% глюкозы и 2,0% агар-агара. Продукт инокулирования готовят путем перелоса исходной культуры в пробирку с 8 мл стерилизованной среды состава, %: триптон 1,7, сойтон 0,3, К2НРО4 0,25, глюкоза 0,25. Продукт инокулирования культивируют в этой пробирке при в течение 2-3 суток при встряхивании, а затем его вносят в одну из приведенных ниже сред для выращивания и получения изомеризующего глюкозу фермента. Среда № 1 содержит следующие компоненты, вес. %: триптон 1,3; сойтон 0,3; К2НРО4 0,25; Д-ксилоза 1,0. Ее разбавляют водой до нужного объема. Величину рН среды устанавливают на уровне 7,0. Питательные вещества (например, -сахар) перед виесением стерилизуют. Среда № 2 отличается от среды № 1 тем, что вместо Д-ксилозы вносят 0,25% Д-глюкозы, в нее вносят также жидкость после вымачивания кукурузы (3%), сульфат двухв алентного кобальта и сульфат двухвалентной меди. Средой jMb 3 является барда, средой № 4 и т. д. - пептоновый экстракт дрожжей, продукт гидролиза казеина, продукт гидролиза соевых бобов, продукт гидролиза белков рыб. Готовят среды и из смесей указанных веществ, К, выбранной из указанных выше сред прибавляют продукт ннокулирования из расчета 5 мл последнего на 75 мл среды с триптоном и сойтоном или на 95 мл среды из жидкости после вымачивания кукурузы, Инкубирование ведут в течение 96 ч при 28С, среду встряхивают на вибрационной установке. По окончании инкубирования клетки выделяют центрифугированием 30 мл культуральной жидкости при скоростй вращения 15000 об/мин в течение 10 мин, промывают водоПроводной водой и суспендируют в 14 мл 0,12 М фосфатного буфера с рН 7,0. Полученную суспензию клеток обр-абатывают ультразвуком при 4°С в течение 4 мин, а затем центрифугируют при 15000 об/мин в течение 15 мин. Верхний слой жидкости можно использовать как сырой источник фермента, вызывающий изомеризацию глюкозы.

Данные об удельной активности полученной глюкозоизомеразы в зависимости от вида культуры и питательной среды представлены в таблице.

Наибольшей активностью отличается глюкозоизомер.аза, полученная при культивировании Actinoplanes missouriensis NRRLB-3342 на среде, содержащей Д-ксилозу.

На качество получаемого фермента оказывает влияние также способ подготовки жидкости после вымачивания кукурузы. Рекомендуется нейтрализацию этой жидкости вести до рН 7,0 щелочью, а затем ее профильтровать.

При приготовлении питательной среды из этой жидкости добавляют сульфат двухвалентного кобальта и сульфат двухвалентной меди с концентрацией соответственно 0,1 мМ и 0,05 мМ.

Наиболее высокие показатели дает применение гидрата окиси натрия (по сравнению с гидратом окиси кальция и гидратом окиси аммония).

Формула изобретения

1. Способ получения глюкозоизомеразы

путем культивирования ее продуцента на питательной среде, содержащей источники углерода, азота и минеральной соли, отличающийся тем, что, с целью повышения активности фермента, из микроорганизмов продуцентов используют штаммы Actinoplanes missouriensis NRRL В-3342, Actinoplanes phillippensis АТСС 12427, Actinoplanes armeniacus АТСС 15676 и Actinoplanes sp. АТСС 23342.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что в качестве источника азота используют или жидкость вымоченной кукурузы, или барду, или гидролизат казеина, или гидролизат соевых бобов, или гидролизат белка рыб, или их смесь.

Источники информации, принятые во вним-ание при экспертизе 1. Патент Великобритании № 1280396, кл. С ЗН, опублик. 1972.