Способ получения препарата на основе белковой сыворотки Советский патент 1980 года по МПК A61K35/14 

У -глобулиновую фракцию II I - I обрабатывают далее следующим образом. Осадок Р погружают в цитрат-фосфатный буфер с рН от 7,0 до 7,4, при температуре 15°С. Добавляют 3% полиэтиленгликоль 4000 (РВУ) или 2,5% РЕ Y 6000. После реакции, продолжающейся от 30 мин до 4 час, смесь подают на центрифугу. Получают супернатант фракцию II1-1 {осадок Р). Супернатант Sj- еще раз обрабатывают и фракционируют при рН 4,6, количество РЕ - около 5% при тем пературе -15°С), Получают фракцию HI (осадок Pg) , а также супернатант 5, который, главным образом, содержит. иммунный глобулин. Глобулин фрак ции II1-1 и III значительно обогаще иммунньоми глобулинами IgG, IgA IgM Кроме того, он содержит -антитрипсин, ,-хаптоглобин, церулоплазмин, траноферрин и хаемопексин. Фракции III-1 и W далее не обрабатывают. В качестве исходного продукта применяют как фракцшо IV, так и фрак ции М1- I и IП. Их смешивают в установленных соотношениях, причем в общих протеинах содержится от 50 до 70% альбулина ил от 50 до 30% глобулина.. Также возможно путем соответствующего повышения добавки части глобулина или фракций J М -1 и IN повысить долю глобулина igM и, IgA. Фракции IV, (И- и 1И cycneHSHp ют в растворе поваренной соли или в другом пригодном буферном растворе, вес.%: Фракция IV30-80 Фракция III - I 0-70 Фракция )II0-70, причем общее количество протеинов 100%. Препарат на основе белковой сыворотки можно получать только из какой-либо одной из фракций I И - I ; III или получить специфичные плаз, мопротеины из отдельных фракций в устойчивой, растворенной форме в качестве препарата. Препарат можно получить из смеси полученных конечных продуктов фракций Itl-I, 1.1 I и IV. Вещества, смешанные в определенных соотношениях и суспензированные в пригодном буферном растворе или в растворе поваренной соли, под вергают предварительной очистке. При предварительной очистке путем адсорб ции на пригодных адсорбентах (аэрози бентонит или другие кремнийсодержащи комплексные соединения) удаляют липи ные факторы JL - и р -глобулинов. Посл этого продукт фильтруют, диализируют и устанавливают нужную концентрацию раствора. Для устранения вирусов производят пастеризацию путем нагрева до 60 С в течение 10 часов. Однако при этих условиях возможна денатурация протеинов сыворотки или же обрабатывают -пропиолактоном и ультрафиолетовыми лучами. Способ поясняется следующими примерами . Пример 1. КЗ00 л раствора . поваренной соли (дистиллированная вода с 1,7% по весу NaCl, который получают в помощью 6,2 н. НС1 с рН 4,6) добавляют 10 kp COHN фракции IV со следующим анализом белка и суспендируют , % г Альбумина55 Х- -Глобулина10 .д -Глобул и на8 Р -Глобулина15 у -Глобулина-12 Фракция IV содержит около 50% твердых веществ (белок, соль) и 50% влажного остатка (, остаточный этанол) . Далее добавляют 5 kp СОНМ фракции II(-1 (субфракция) со следующим анализом твердых составляющих, вес.%: Альбумина15 olw -Глобулина2 ,д -Глобулина13 (-Глобулина17 /д -Глобулина , 53 и 5 kp COHN субфракции IN-2 со следующим анализом суспензируется,- вес.%: Альбумина .8 di -Глобулина3 сС -Глобулина9 р -Глобулина25 Jr-Глобулина55 Соотношение твердого вещества и влажного остатка во всех фракциях практически одинаковое. 20 kp флажной фракции суспензируют в растворе и перемешивают. При этом значение рН поддерживают достоянным и равным 4, б. Растворимая субстанция,, имеющаяся в растворе, растворяется. Имекедаяся нерастворимая . субстанция дает помутнение раствора и составляет около -12% по отношению к всему количеству твердых составляющих. Среди нерастворимых веществ имеются, в частности, денатурированные глобулины, включая липопротеиды, которые на дальнейших ступенях способа не нужны. Последние удаляют путем центрифугирования. Оставшаяся жидкость имеет слабую мутность и желтоватый цвет. Добавляют 0,2 NaOH, устанавливают значение рН на 7,4. В раствор добавляют чистую колоидную кремниевую соль до достижения концентрации 5 вес.% и все перемешивают. Жидкость подогревают до (около 1 -в минуту) и значение рН поддерживают постоянным. После достижения температуры 45 С жидкость перемешивают в течение 4 часов. Во время процесса длительноустойчивые протеины соединяются с кремниевой кислотой и образуют осадок, который удаляют центрифугированием. Жидкость, оставшуюся после центрифугирования, осветляют при пропускании ее через фильтр с активированным углем. После этого фильтрат становится прозрачньм янтарного цвета. Далее жидкость концентрируют до 25% по отношению к исходному объему с по мощью способа диаконцентрации (миллипоры - кассетная система, мембрана - величина пор 10.000 дальтон). После этого концентрация белка в рас творе составляет 3,4-4,5 вес.%. Анализ показывает, что благодаря диаконцентрационной ступени все фрак ции, составляющие кровь с молекулярным весом, меньшим 10.000, из концен рата удаляют.К ним принадлежат фрак ции, которые нежелательны для консервирования, например олигопептиды с вазоактивньш действием. После этого для окончательного удаления примесей, а также электролитического установления диализа, обработку ведут трехкратным раствором, 0,9%-ного NaCB. Диализ проводя в одинаковых аппаратах с одинаковыми мембранами, которые применяют при концентрирювании. Последукяцее концентрирование заканчивают установлением концентрации протеина 6-10%. После этого с помощью раствора NaC8 устанавливают физиологические условия изотонии, присущие человеческой крови, и общая концентрация протеинов становит ся равной 5% Анализ полученных в примере 1 пр теинов показал следующие значения, мг: (содержание в 100 мл) Протеин5.000 Альбумин2.925 .500 IgA380 IgM.285 Полученный раствор фильтруют дополнительно через стерилизующие фильтры. Благодаря мембранным фильт рам происходит стерильная фильтраци После этого препарат готов для внутривенной инъекции. Пример 2. ВЗООл раствора как и в примере 1, растворяют, kp: 7,5 COHN фракции I.V 4 COHN фракции III-I 8 COHN фракции tII Состав этих соответствует примеру 1. Фракции перемешивают с растворителем, значение рН поддержи вают 4,6. В раствор добавляют 60 г на литр аэрозила и значение рН уста навливают равным 7,6 и смешивают п температуре 47°С в течение 4 часов, после этого раствор охлаждают до 18 и гидравлически фильтруют. Гидравли ческую фильтрацию производят в намы ных фильтрах, тип CHF-S. в качестве фильтровального средства используют Super Cet 8%-ной концентрации на общее количество фильтрата. В качестве фильтровального средства можно применять также кизельгур целит 545 в 5%-ной концентрации . Пример 3. После очистки растворы разделяют и подвергают обработке способом диаконцентрирования,как в примере 1. Их можно при желании обрабатывать до получения конечного концентрата по способу, описанному в примере 1,и после этого по выбору соединять в любой состав. Пример 4. В 200 л фосфатноцитратного буферного раствора (0,66 моль фосфат-цитрата) растворяют 10 kp фракции III в течение 3 часов. Значение рН устанавливают 7,5 и после последующего разбавления в 300 л перемешивают с упомянутым буферным растворе при добавлении 100 г/л аэрозил/бентонита (2:1) в течение 4 часов при-45 с. После охлаждения до 10°С суспензию фильтруют на наливном фильтре через фильтрат, в качестве которого применяют кизельцелит .545, количество которого на 1 м- фильтровальной поверхности составляет 1,0 кг, причем мощность фильтра 50 л/м час. Фильтрация происходит как и диаконцентрирование в примерах 1-3. Раствор готового конечного концентрата содержит 5% белка. При этом средний состав следукяций, мг : Протеин5000 Альбумин Около 1SOO-2000 Глобулин3.000-3200 Ig fОколо 1.450 IgAОколо 700 IgMОколо 500 Пример 5. COHN фракции 1-1II и IV-I с концентрацией этанола 40% и со значением рН 5,8 выделяют в ступени. Под фракцией IV-I следует понимать фракцию, идентичную фракции IV. Осадок изолируют 20 кг преципитата , как и в примере 1 погружают в 300 л растворителя и далее обрабатывают. Пример 6. Фракционирование человеческой плазмы производят спомощью риванола (2-этокси-6,9-дигилино-ацидинилацетат), при этом выпадают осадки II, III и IV. Эти осадки можно по предлагаемому способу обрабатывать до получения препарата белковой сыворотки. По 10 kp каждого осадка, т.е. вместе это составляет 30 kp, вносят в 300 л растворителя, как и в примере 1. Дальнейшую обработку производят также, как и в примере 1. Пример 7. В 200 л раствора поваренной соли (дистиллированная. вода с 1,7 вес.% NaCB, у которой величина рН при помощи 0,2 н. НС устновлена в 4,б и которая ниже называется растворителем) добавляют 6,0 kp COHN фракции IV со следующим анализом компонентов белка и суспендируют, вес,%:

Альбумина53

оС,-Глобулина 11

j

Ч -Глобулина 8

-Глобулина 14

Га1 маглобулина 14

Затем добавляют 4,0 kp COHN подфракций IN со следукщим анализом белковых компонентов, вес.%:

Альбумина7

(JL;, -Глобулина 3

.д -Глобулина9

Р -Глобулина 26

Гаммаглобулина 56

Соотношение остаточной влажности (, остаточный этанол) и твердых веществ (белки, соли) составляют окло 1:1.

10 kp влажной фракции суспендируют в растворителе и размешивают. При этом величину рН поддерживают постоянно 4, 6. Следующие стадии протекают, как описано в примере 1 (центрифугирование; обработка креневой кислотой, фильтрование на активном угле, концентрирование диализом) .

На 100 мл раствора при 5.000 мг установленного содержания протеина

получают около 37% сшьбумина, соответственно 1.850 мг, около 63% глобулинов, соответственно 3.150 мг, содержание иммунных, глобулинов, мг: IgG Около 1.450 IgA Около 700 IgM Около 500 Предлагаемый способ позволяет получить препарат на основе белковой сыворотки с повышенным содержанием иммуноглобулина.

Формула изобретения

Способ получения препарата на основе белковой сыворотки путем фракционирования плазмы с последующей адсорбцией, очисткой и стерилизацией, отличающийся тем, что, с целью повышение содержания иммуноглобулина , плазму освобождают от продуктов коагуляции, фракционируют по способу Кона, из полученной после фракционирования фракции III выделяют фракции III-I и 111-11, последние смешивают с фракцией. IV и суспендируют смесь в физиологическом растворе.

Источники , принятые во внимание при экспертизе i

1, W.Stephan - Vox Sanguim, 442457, 1975.