Способ очистки гамма-глобулина для внутривенного введения Советский патент 1993 года по МПК A61K37/04 A61K35/16 

Изобретение относится к медицине, а именно к химико-фармацевтической промышленности.

Цель изобретения - повышение качества препарата, создание препаратов гамма-глобулинов, вводимых внутривенно, одновременно не имеющих агрегатов и димеров, без антикомплементарного свойства, калликреина и активатора пре- калликреина и с профилем подкласса, сравнимым с профилем нормальной Serum Humain (сыворотка человека), а также создание способа, применимого к препаратам гамма-глобулинов, полученных фракционированием небольшими количествами ПЭГ или аналогичных веществ, который улучшает эти препараты, в частности, уменьшая антикомплементарную способность, содержание калликреина и активатора прекал- ликрена, а также остаточной ПЭГ.

Предлагаемый способ включает в себя этап фракционирования полиэтиленглико- лем или подобными веществами и этап умеренной обработки энзима, при котором величина рН зависит от типа используемого энзима, добавляемого предпочтительно в ничтожном количестве, при этом обработка производится во избежание значительного протеолиза.

Используемый энзим выбирают из группы, образованной пепсинами, фибриноли- зинами (плазминами) и папаинами.

Исходным материалом служит фракция сывороточного происхождения с большим содержанием гамма-глобулинов, например фракция II техническая Кона 6,9, известная

00

ю ю о со со

со

тем, что она дает продукты, свободные от гепатита, или фракция плацентарного происхождения, например фракция техническая 6,9 Кона, модифицированная по Тейлору. Эта фракция имеет чистоту 1gG, равную 90% или большую. Она может содержать переменное количество альбумина (до 10%).

Пример 1.

1.Осаждение с использованием ПЭГ.

Исходный материал готовят путем растворения осадка II Technigue 6-9 de Conn и осветления этого раствора.

Концентрацию белков устанавливают 10 г/л, а альбумина - 0,5 г/л.

Осаж/ )ние осуществляют путем добавления полиэтиленгликоля (ПЭГ) с мол.м. 4000 с целью получения концентрации ПЭГ в 5% (мол,/об). Величину рН регулируют с величины до 5,8 с помощью соляной кислоты 0,1 н,а температуру поддерживают между 0 до 4°С. Ионная сила очень мала, порядка 0,02,

Получают осадок, содержащий агрегаты, которые отделяют затем от раствора простым отстаиванием, фильтрованием или центрифугированием. Осадок удаляют.

Используя полученное таким образом всплывшее вещество, осуществляют новое осаждение без дополнительного добавления ПЭГ, при той же самой температуре, но с увеличением ионной силы до 0,05 путем добавления NaCI и доведением рН до 8.

В этом случае гамма-глобулины осаждают и образованный таким образом осадок отделяют от жидкой фазы отстаиванием или центрифугированием.

Этот осадок включает гамма-глобулины, не содержащие агрегатов с высокой молекулярной массой, однако способные еще содержать пропорцию около 10% димеризованных белков. Электрофоретиче- ская чистота этого продукта близка к 90%. Антикомплементарная активность очень мала. Процентное содержание калликреина и активатора предкалликреина мало, но они могут присутствовать в переменных количествах, в зависимости от содержания используемого исходного вещества.

2.Ферментная обработка.

Осадок гамма-глобулинов растворяют в апирогенной воде так, чтобы получить концентрацию 20 г/л по белкам. Добавляют 50 г/л сахарозы и 0,25 М.Ед. пепсина на миллиграмм белка. При доведении температуры до 37°С и при ее поддержании, с установленным рН 4,1, инкубируют в течение 15ч, После обработки, рН доводят до нейтрального.

3.Последующая обработка.

Осуществляют ультрафильтрацию так, чтобы довести концентрацию раствора гамма-глобулина до 70 г/л.

За этим этапом ультрафильтрации сле- дует диафильтрация, предназначенная для удаления ПЭГ. Эту же диафильтрацию проводят с помощью раствора NaCI 4,5 г/л. Объем используемого диафильтрационного раствора зависит от содержания ПЭГ, под- лежащего удалению. Обычно объем, соответствующей 8-кратному объему раствора IgG, позволяет удалить свыше 90% ПЭГ, содержащегося вначале в растворе, и перейти, таким образом, от содержания в 1,5 г/л до 5 0,10 г/л.

Затем доводят полученный раствор до содержания 50 г/л белка, 50 г/л сахарозы, 4,5 г/л хлористого натрия, при рН 7,0.

Распределяют это вещество во флаконы 0 по 0,5-2,5 или 5 г гамма-глобулинов, затем осуществляют лиофилизацию.

Пример 2.

1.Осаждение с помощью ПЭГ приводят аналогично примеру 1.

5 2. Ферментную обработку, осуществля- ютаналогично примеру 1, с использованием пепсина в растворе в несолибизированном виде на традиционных носителях. Продолжительность инкубирования 24 ч.

0 ПримерЗ. Исходный материал готовят растворением плазматического осадка II Technigue 6-9 Cohn и осветлением этого раствора. Содержание белков доводят до 120 г/л, альбумина - до б г/л.

5 1. Ферментная обработка.

Проводят слабую обработку фибрино- лизина человека. Концентрация фибриноли- зина человека 4 М.Ед./г белка, рН 7,4.

Продолжительность инкубирования 4

0 дня при температуре 4°С для достижения отсутствия гипотензивных факторов, подтвержденных испытанием на давление у крыс.

2.Осаждение с помощью ПЭГ.

5 Проводят этап осаждения белкового раствора, разбавленного до 10 г/л белков путем добавления ПЭГ с мол.м. 4000, с тем, чтобы получить концентрацию ПЭГ 5%. Величину рН регулируют до 5,8 с помощью HCI

0 0,1 н. и поддерживают температуру между О и 4°С. Ионная сила очень мала, порядка 0,02.

В результате получают осадок, содержащий агрегаты, которые затем отделяют от

5 раствора простым отстаиванием, фильтрованием или центрифугированием. Осадок удаляют,

Используя полученное всплывшее вещество, проводят новое осаждение, без нового добавления ПЭГ, при той же самой

температуре, но с увеличением ионной силы до 0,05 путем добавления NaCI от 0,05 до 0,2% и доведения рН от 7 до 8,5, предпочтительно до 8,0.

В этом случае гамма-глобулины осаждают и отделяют от жидкой фазы полученный таким образом осадок путем отстаивания или центрифугирования.

3. Последующая обработка.

Проводят ультрафильтрацию с тем, чтобы довести концентрацию раствора гамма- глобулинов до 70 г/л.

За этим этапом ультрафильтрации следует диафильтрация, предназначенная для удаления ПЭГ. Эта диафильтрация проводится с помощью раствора NaCI 4,5 г/л. Объем применяемого раствора для диа- фильтрации зависит от подлежащего удале- нию содержания ПЭГ. Обычно объем, соответствующий 8-кратному объему раствора, позволяет удалить свыше 90% ПЭГ, содержащегося первоначально в растворе, и довести, таким образом, содержание до 1,5 г/л до 0,10 г/л.

Затем осуществляют регулирование полученного раствора до содержания 50 г/л, белков, 50 г/л сахарозы, 4,5 г/л хлористого натрия при рН 7,0.

После этого распределяют вещество по флаконам по 0,5-2,5 или 5 г гамма-глобулинов, затем осуществляют лиофилизацию.

Пример 4. Исходный материал готовят растворением плазматического осадка II Technigue 6-9 de Cohn и осветлением этого раствора. Чистота по глобулинам близка к 100%. Содержание белков доводят до 120 г/л.

1,Ферментную обработку проводят аналогично примеру 3, кроме концентрации фибринолизина человека в 2 М.Ед./г.

Время инкубирования составляет 10 дней при 4°С.

2.Осаждение с помощью ПЭГ проводят аналогично примеру 3.

Пример 5. Исходный материал готовят растворением плазматического осадка I Technigue 6-9 de Cohn и осветлением этого раствора. Содержание белка затем доводят до 120 г/л, альбумина - до 6 г/л,

1.Ферментную обработку проводят аналогично примеру 4.

2.Осаждение с помощью ПЭГ, осуществляют аналогично примеру 3, но этап осаждения с помощью ПЭГ проводится при содержании 40 г/л белков.

Пример 6. Исходное сырье представляет собой фракцию II Technigue 69 de Cohn с чистотой по гамма-глобулинам 95%. Его доводят до 5% по альбумину.

Этот раствор доводят до содержания 20 г/л по белкам.

1. Ферментная обработка. Папаин добавляют в пропорции 6 М.Ед./г белка.

Величину рН регулируют на 7,0. Время инкубирования менее 24 ч (18 ч) при 37°С. Аналогично примеру 3. Пример 7. Идентичен примеру 6, 0 кроме пропорции папаина (12 М.Ед. на г белка).

Длительность инкубирования 5 ч при 37°С.

П р и м е р 6. Исходное сырье представ- 5 ляет собой техническую фракцию II 6-9 по Кону с чистотой по гамма-глобулинам 95%. Ее доводят до 5% по альбумину.

Этот раствор доводят до содержания 20 г/л по белкам. 0 1. Умеренная обработка энзимами.

Папаин добавляют в пропорции 5 М.Ед./г белка.

Величину рН регулируют на 7,0. Время инкубирования-менее 24 ч(18ч) при 37°С 5 2. Осаждение с помощью ПЭГ.

Осуществляют этап осаждения протеинового раствора, разбавленного до концентрации 10 г/л протеинов, путем добавления полиэтиленгликоля (ПЭГ) с мол;м, 4000 до 0 получения 5%-ной концентрации ПЭГ. Ве- личину рН доводят до, 5,8 с помощью 1 н. соляной кислоты и поддерживают температуру в интервале 0-4°С. Ионная сила очень низкая, порядка 0,02.

5 Таким образом получают осадок, который содержит агрегаты, отделяемые от раствора простым отстаиванием, фильтрацией или центрифугированием. Осадок удаляют. Полученную недостаточную жидкость 0 затем снова подвергают осаждению без добавления ПЭГ при той же температуре, но увеличивают ионную силу до 0,05 путем добавления 0,05%-0,2% NaCI и доводят величину рН до 7-8,5, предпочтительно 8,0. 5 Гамма-глобулины выпадают в осадок; образовавшийся таким образом осадок отделяют от жидкой фазы путем отстаивания или центрифугирования.

3. Последующая обработка. 0Производят ультрафильтрацию, доводят концентрацию раствора гамма-глобулинов до 70 г/л.

После ультрафильтрации производят диафильтрацию, предназначенную для уда- 5 ления ПЭГ. Диафильтрацию осуществляют с помощью раствора 4,5 г/л NaCI. Объем применяемого раствора для диафильтрации зависит от количества удаляемого ПЭГ. Как правило, объем, равный 8-кратному объему раствора IgG, позволяет удалить более 90%

ПЭГ, первоначально содержащегося в растворе, и довести, таким образом, его содержание до 1,5-0,10 г/л.

Затем полученный раствор доводят до содержания 50 г/л протеина, 50 г/л сахарозы, 4,5 г/л хлорида натрия, до величины рН 7,0.

Затем вещество распределяют во флаконы 0,5-2,5 или 5 г гамма-глобулина и производят после этого лиофилизацию.

Анализ гамма-глобулинов, полученных согласно изобретению, выявляет следующие преимущества: уменьшение антикомплементарной способности при различных методиках определения; уравновешивание подклассов; отсутствие гипотензивных факторов, подтвержденное испытанием давления на собаке и на крысе; уменьшение количества димеризованных белков более чем на 50% по отношению к первоначальному содержанию и получение очень высокого содержания мономеров (близкое к 90%). При этом содержание фрагментов менее 7S нулевое или очень незначительное; содержание калликреина и активатора предкал ликреина нулевое (ниже предела чувствительности испытания); остаточное содержание ПЭГ уменьшено более чем в 10 раз по сравнению с первоначальным.

Формула изобретения

1, Способ очистки гамма-глобулина для внутривенного введения путем осветления обогащенной гамма-глобулинами фракции, в частности, фракции II технической 6,9 по Кону или технической фракции 6,9 по Кону, модифицированной по Тейлору, ее инкуби-

10

рования с энзимом, выделения о лиофили- зации целевого продукта, отличающий- с я тем, что, с целью повышения качества, в качестве энзима при инкубации используют человеческий фибринолизин, инкубацию проводят при нейтральном рН в течение 2-10 сут, или пепсин при рН 4 и длительности инкубации втечение10-24ч,или папаин при нейтральном рН в течение 18 ч, а выделение проводят путем фракционирования посредством добавления ПЭГ при рН 5,8, удалении образовавшегося осадка, осаждения целевого продукта при рН 8, далее концентрируют целевой продукт посредством 15 ультрафильтрации, удаляют из концентрата ПЭГ и повышают содержание протеина в полученном растворе до 50 г/л.

2.Способ по п.1, о т л и ч а ю щ и и с я тем, что при инкубации с пепсином сначала проводят выделение, а затем инкубацию с ферментом.

3.Способ по п.1,отличающийся тем, что выделение путем фракционирования ПЭТ проводят до концентрации ПЭГ5% при температуре 2-4°С и ионной силе 0,02, а осаждение целевого продукта при ионной силе 0,05, при содержании белка от 1 до 4%.

4.Способ по п.1, отличающийся тем, что обработку нерастворимым пепсином осуществляют в количестве 0,002 г/л на раствор 20 г/л гамма-глобулина в присутствии сахарозы.

5.Способ по п.1,отличающийся тем, что обработку фибринолизином челове35 ка осуществляют в количестве 0,5-4,0 кЕ/г протеина.

20

25

30

Изобретение относится к медицине, а именно к химико-фармацевтической промышленности. Осветляют обогащенную гамма-глобулинами фракцию II технической 6,9 по Кону или технической фракции 6,9 по Кону, модифицированной по Тейлору, инкубируют ее с человеческим фибринолизином, или пепсином, или папаином при определенных условиях и затем целевой продукт выделяют осаждением ПЭГ, дальнейшем осаждением при рН 8. Концентрируют продукт ультрафильтрацией, удаляют ПЭГ из концентрата повышают содержание протеина до 50 г/л и лиофильно высушивают. Положительный эффект заключается в уменьшении в продукте веществ, обладающих антикомплементарной и гипотензивной активностью, в уменьшении содержания прекалликреинового активатора и снижении содержания агрегатов и ди- меров. 4 з.п.ф-лы.