Способ получения тромболитического фермента Советский патент 1980 года по МПК C12D13/10 

(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ТРОМБОЛИТИЧЕСКОГО ФЕРМЕНТА Изобретение относится к медицине а именно к способам получения биологически активных препаратов. Известен способ получения тромболитического фермента путем выращивания гриба Т гichothe сiurn roseum, экст ракции сопутствующего антибиотика трихоцетина органическим растворителе м с последующим осаждением целевого продукта органическим раствори телем и его очисткой l . Однако известный способ не обеспечивает высокой чистоты препарата, а выход его составляет 500 мг сырца или нативного протеолитического бел ка - фермента из 1 я культуральной жидкости. Цель изобретения - повышение выхода и чистоты фермента. Указанная цель достигается тем, что целевой продукт осаждают 96 -ни этиловым спиртом при (-4)-(-7)°С и рН 6,8-7,0, отделяют осадок центрифугированием при- (-3)-{-2)°С, затем полученный осадок растворяют в охла денной апирогенной воде из расчета 1,5-1,55 г на 10-10,5 мл воды и про водят очистку при . Кроме того,, целевой продукт очищают последовательно осветляющей фи трацией, диализом против дистиллированной воды и стерилизующей фильтрацией . Пример. 100 л культуральной жидкости с активностью 400 мм или 2664 уд.ед/мг после отделения от мицелия помещают в реактор при 20-22°С и экстрагируют затем 4 л хлористого метилена посредством непрерывного перемешивания в течение 10 мин и последующего отстаивания в течение 1 ч. Экстракт, содержащий антибиотик, удаляется через нижний спуск реактора. Измеряют объем водного слоя, содержащего фибринолитические ферменты. Водный слой перекачивают в реактор, который имеет рубашку с рассолом для Поддержания рабочей температуры (-4)(-8)°С. Далее проводят осаждение фибринопитических ферментов трехкратным объемом 96 -ного этилового спирта, предварительно охлажденного до -10°С Осаждение проводят при (-4)-(-7) С и рН 6,8-7,0. Выпавший через 3 ч осадок отделяют центрифугированием в течение 10 мин при 2.000-2.500 тыс.об/ /мин на центрифуге с охлаждением до -3°С. Полученную массу фибринолитических ферментов (1 кг 800 г) растворяют

в апирогенной .дистиллированной воде (из.расчета 1,5 г осадка на 7,0 мл воды). Раствор подвергают осветляющей фильтрации посредством пропускания его через бумажное тесто под вакуумом. После окончания фильтрации бумажное тесто промывают дистиллированной водой (из расчета 3 мл воды на 1,5 г осадка) для полного .выхода фибринолитических ферментов и бумажного теста в раствор. Фильтрат диализуют в целлофановых мешках марки 250-7И против апирогенной дистиллированной воды в течение 48 ч при 0°С, а затем подвергают стерилизующей фильтрации через фильтры марки Миллипор при величине пор сте зиллизующей пластины 0,22-0,3 мкм и разливают в пенициллиновые флаконы по 2-3 мл. Разлитый фильтрат замораживают и лиофильно высушивают в течени 24 ч при максимальной температуре подогрева 20°С,

Полученный препарат представляет собой аморфное вещество белого цвета хорошо растворимое в дистиллированной воде и ф.изиологическомрастворе, и является комплексом фибринолитических ферментов.

Применение хлороформа для экстракции антибиотика (из расчета 4 л хлороформа на 100 л культуральной жидкости) не изменяет схемы способа получения тромболитического препарата.

Использование предлагаемого способа выделения фибринолитических ферментов из непатогенных плесневых грибов Т г 1chothocium roseum обеспечивает увеличение выхода препарата-сырца в 3,6 оаза. Кроме того, улучшаются тромболитические свойства препарата, которые выражаются в достижении 80% полного лизиса экспериментальных тромбов.,

В опытах in vitro установлено,что добавление небольших количеств препарата к плазме вызывает быстрый лизис кровяного сгустка. Увеличение концентрации препарата препятствует образованию сгустков. Оптимальная

концентрация, способствующая лизису тромбов, равна 15 мг/мл, При изучении ферментативных свойств обнаружено, что препарат обладает способностью активировать плазминоген. Выделенный протеолитический фермент обладает фибринолитической активностью в 3 раза большей, по сравнению с фибринолизином.

Внутривенное вбеденне препарата животным вызывало у большинства из них лизис тромбов в течение 1-9 ч, в то время как в контроле лизис тромбов не отмечался в течение опыта (24 ч). Применение препарата в сочетании с гепарином сокращает сроки лизиса сгустков в 3-4 раза (возрастает тромболитическая эффективность препарата).

Формула изобретения

1,Способ получения тромболитического фермента путем выращивания гриба ТгichothecI urn roseum, экстракции сопутствующего антибиотика трихоцетина органическим растворителем

с последующим осаждением целевого продукта органическим растворителем его очисткой, отличающийс я тем, что, с целью повышения выхода и чистоты фермента, целевой продукт осаждают этиловым спиртом при температуре (-4)-(-7) С и

рН 6,8-7,0, отделяют осадок центрифугированием при (-3) - (-2)С, затем полученный осадок растворяют в охлажденной апирогенной воде из расчета

5 1,5-1,55 г на 10-10,5 мл воды и проводят очистку при 0-1 С,

2,Способ по п, 1, о т л и ч а ющ и и с я тем, что целевой продукт очищают поспецоватепъно осветляющей

0 фильтрацией, диализом против дистиллированной воды и стерилизующей фильтрацией ,

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе 5 1, Авторское свидетельство СССР № 469348, кл, С 12 D 13/1Ь, 1973,