Способ получения тромболитического фермента из гриба ТRIснотесIUм RоSеUм штамм D Советский патент 1988 года по МПК A61K38/46 C12N9/58 

(21)4169377/28-13

(22)24.12.86

(46) 07.09.88. Бюп. № 33

(71)Центральный научно-исследовательский институт гематологии и переливания крови

(72)Н.С.Мурашова, И.В.Иванова, М.А.Козлова, А.В.Сиротенко, Р.А.Максимова, Г.В.Андреенко, Б.В.Макарова и В.И.Данилина (53) 577.15(088.8)

(56) Авторское свидетельство СССР № 584034, кл. С 12 N 9/72, 1975. Авторское свидетельство СССР № 787463, кл. С 12 N 9/00, 1978.

.() СПОСОБ ПОЛУНЕНИЯ ТРОМБОЛИТИ- ЧЕСКОГО ФЕРМЕНТА ИЗ ГРИБА TRICHOTECIUM ROSEUM ШТАММ D

(57) Изобретение относится к производству ферментных препаратов и может быть использовано в медицине. С целью получения фермента триазы повышенной

степени очистки из. культуральной жидкости Trichotecium roseum штамм D осадок триазы растворяют в 0,2 М натрий-ацетатном буфере рН 4,0-4,2, пропускают через аниокообменник - гемосорбент СКН, затем катионообмен- ник - биокарб Л, проводят отмывку катионообменника от балластных белков с помощью 0,1 М натрий-ацетатного буфера рН 4,0-4,2 и десорбудию проводят 0,2 М ам юний-ацетатным буфером рН 8,0-8,4, полученный раствор фермента , подвергают стерилизующей фильтрации и лиофильной сушке. Получают апироген- ную триазу, состоящую из 2 индивидуальных белков с молекулярными массами 9300 и 17300 дальтон в отличие от исходной триазы, состоящей из 7 индивидуальных белков. Преимущество предложенного способа заключается не только в повышении степени очистки фермента, но и в использовании для очистки дешевого сырья и дешевых отечественных анионо- и катионообменников, 1 ил., 4 табл.

иэ

4;;i.

ю

со

й оо

Изобретение относится к производству ферментных препаратов и может быть использовано в медицине.

Цель изобретения - повьшение сте- пени очистки фермента тромболитическо :Го действия.

: Сущность способа заключается в том, что исходный продукт, в качеств которого используют осадок триазы, полученйый в результате спиртового осаждения культуральной жидкости Trichotecium roseum штамм D, растворяют в 0,2 М натрий-ацетатном буфере рН 4,0-4,2 (данные значения рН обес печивают наиболее полное растворение осадка). На 20-25 г осадка берут 300-350 мл буфера. Нерастворившуюся часть осадка отделяют путем фильтра- ции через бумажный фильтр. Весь экст- ракт наносят на колонку с анионооб- менником. В качестве анионообменника подобран гемосорбент СКН. Отработан режим хроматографии: диаметр колонки 22 мм, высота разделяющего слоя 80- 90.мм, скорость сорбции 100-120 мл/ /ч/см о Собирают фракции по 10-13 мл, в которых определяют рН. Фракции, имеющие рН больше, чем исходные значения буфера (4,0-4,2) отбрасывают, а остальные фракции объединяют и наносят на колонку с катионообменни- ком.

в качестве катионообменника подобран биокарб Л., Диаметр колонки 22 Mk, высота разделяющего слоя 40-50 мм, скорость сорбции 100-120 мл/ч/см. После сорбции колонку промывают 0,1 М раствором натрий-ацетатного буфера рН 4,0-4,2 со скоростью 50-60 мл/ч/см. Десорбцию триазы проводят с помощью 0,2 М аммоний-ацетатного буфера рН 8,0-8,2 (при данных значениях рН наблюдается наиболее полное снятие с колонки нанесенного материала). Собирают фракции 10-15 мл в которых определяют объем, фибри- нолитическую активность по методу Astrup и оптическую плотность при 280 нм (спектрофотометрически). Фракции, обладающие фибринолитической активностью, объединяют, подвергают стерилизующей фильтрации и лиофильно высушивают. Затем полученные фракции растворяют в изотоническом растворе

хлорида натрия в количестве, равном объему фракций до сушки и ставят на пироген-тест в соответствии с требованиями X Государственной Фармакопеи

г-

е ю Н5 20 25 зО

,Q дд,

50

55

СССР. Апирогенной считают .ту фракцию, которая дает максимальное ПовьЩ1ение температуры у одного кролика не выше 0,6 С, снижение не больше, чем на 0,, а сумма максимальных повы- щений у трех кроликов не превышает 1,.

3 л культуральной жидкости, полученной в результате биосинтеза гриба Trichotecium roseum штамм D, охлаждают до -1 Си добавляют 9 л 96-градусного этанола, предварительно охлажденного до -15°С. Конечная температура осаждения -4°С. Устанавливают рН 7,0. Через 18 ч образуется осадок триазы, который отделяют центрифугированием. Полученный осадок (20 г) растворяют в 300 мл 0,2 М натрий-ацетатного буфера рН 4,0, Нерастворившуюся часть осадка отделяют при фильтровании через бумажный фильтр.

Затем экстракт в количестве 260 мл наносят на колонку с анионо- обменником гемосорбентом. Диаметр колонки 22 мм, высота разделяющего слоя 82 мм. скорость сорбции 100 мл/ч/см. Сорбируют фракции по 13 мл. Получены 21 фракция. Определяют рН фракций.

В табл. 1 представлены значения рН в различных фракциях триазы.

Фракции, имеющие рН больше 4,0 (с 1-й по 5-ю фракцию), отбрасывают, а фракции с 6-й по 21-ю (рН 4,0) объединяют и наносят на колонку с катионообменником биокар- бом Л. Диаметр колонки 22 мм, высота разделяющего слоя 44 мм, скорость сорбции 100 мл/ч/см. После сорбции колонку промывают 100 мл 0,1 М раствора натрий-ацетатного буфера со скоростью 50 мл/ч/см. Десорбцию триазы проводят с помощью 250 мл 0,2 М аммоний-ацетатного буфера рН 8,2. Скорость десорбции 20 мл/ч/см. Сог бирают фракции по 10-15 мл, в которых определяют рН, фибринолитическую активность, оптическую плотность при 280 нм.

В табл. 2 даны результаты хрома- тографического вьщеления триазы с использованием гемосорбента и био- карба.

На чертеже дан график зависимости фибринолитической активности фракций и их плотности при 280 нм от объема фракций.

Как видно из чертежа, получают 2 пика фибринолитической активности и соответствующие им 2 пика белка. Фракции, входящие в состав этих пиков, объединяют, подвергают стерилизующей фильтрации и лиофильно высушивают. Затем лиофильно высушенный фермент растворяют в изотоническом растворе хлорида натрия в количестве, равном объему раствора до сушки, и полученный раствор вводят внутривен:- но кролику для постановки пироген- теста согласно X Государственной Фармакопее СССР.

В табл. 3 представлены данные по температурной реакции кроликов на введение триазы.

Максимальное повьшение температуры у одного кролика для 2 пика 0,6 С, а суммы максимальных повышений температуры у 3 кроликов 1,, что характеризует 2 пик как апирогенный, 1 пик дает пирогенную реакцию (максимальное повьш1ение температуры у 1 кролика 1,,а сумма максимальных повышений 3,).

В табл. 4 представлены данные по температурной реакции кроликов на введение триазы, полученной при использовании 2 .схем очистки.

Как видно из данных табл. 4, именно сочетание гемосорбента и биокар- ба Л обеспечивает получение апиро- генной триазы.

-Сравнение белкового состава апи- рогенной триазы и триазы, описанной в прототипе и используемой как ис1 2 3 4 5 6 7

4213484

ходный продукт в предлагаемом способе, показало, что в отличие от исходной триазы, состоящей из 7 индI видy- альных белков, в состав апирогенной триазы входят 2 индивидуальных белка . с молекулярными массами 9300 и 17300 дальтон, что свидетельствует о повышении степени очистки триазы

10 за счет удаления ряда белков.

Преимущество предлагаемого способа заключается в использовании доступных дешевых отечественных анионо- и катионнообменников и

15 сырья и получении апирогенного фермента высокой степени очистки.

Формула изобретения

Способ получения тромболитического. фермента из гриба Trichotecium го- seum штамм D, включающий осаждение целевого продукта из культуральной, жидкости органическим растворителем

и отделение фибринолитического осадка, очистку, стерилизующую фильтрацию и лиофильную сушку, отличающийся тем, что, с целью повьш1ения степени его очкстки, осадок

растворяют в 0,2 М натрий-ацетатном буфере рН 4,0-4,2, очистку ведут пропусканием через аниокообменкик - гемосорбент СКН, затем катионооб- менник - биокарб Л, проводят отмьшку катионообменника от балластных белков с помощью М того же буфера с десорбцией 0,2 М аммоний-ацетатным буфером рН 8,0-8,2,

.Таблица 1

15 16 17 18 19 20 21

4,0 4,0 4,0 4,0 4,0 4,0 4,0

Таблица 2

и

и

1 2 3

4 5 6

-I-I-I-I-I-I-I-п-I-г-I-г 123 5 6 7 в 3W1U213 Н 516

Таблица 4

0,9 0,8 1,0

0,5

0,3

-0,2

1,1

0,3 0,0 0,2

газракции capSeHfna