Способ получения бактериальных аллергенов Советский патент 1980 года по МПК A61K39/35 

Изобретение относится к медицинской промышленности и касается получения бактериальных аллергенов. Известен способ получения бактериальных аллергенов путем выращивания микроорганизмов в жидкой питательной среде с последующим отделением биомассы, выделением целевого продукта путем осаждения из надосадочной жидкости, растворением осадка, его очисткой и стерилизацией l. Однако известный способ не обеспечивает высокой специфичности аллергенов. (Содержание белка в 1 диагностической дозе аллергена; для золотистого стафило кокка 60-13О, кишечной палочки 35-75 стрептококка группы А 15-ЗО, протея мирабилис 4-12 мг). Цель изобретения - повышение специфичности аллергенов. Достигается это тем, что растворенны осадок очищают с помощью гель-хромато графии я выделяют фракции с 1«флекулярным весом выше ЗОООО. Способ осуществляют следующим образом. Приготавливают маточные культуры. Для изготовления используют сухие штаммы культур соответствующего вида. Штаммы высевают раздельно в пробирки с питательным бульоном и выращивают при 37°С в течение 18-20 ч, после чего пересевают на мясо-пептовый агар. После двух пассажей делаютвысев на серийную питательную среду, состоящую из-смеси бульонов Мартена и Хоттин- гера с добавлением 6,2% глюкозы и рН 7,2-7,4Бульонную культуру через 1820ч выращивания проверяют на чистоту путем микроскопии. Питательные среды, разлитые в матрацы по 5Омл, засевают 18-20 часовыми бульонными культурами. Плотность посева 1ОО-150млн микробных тел на 1мл среды. Матрацы хорошо перемен:ивают и помещают в термостат при С в наклонном положении под углом 1О-20 Через 5-6 суток культуру из каждого матраца аровершот на чистоту путем мик роскопнрования, затем центрифугируют в течение 1ч при 3000 об/мин. Супернатанты из культуры разных штаммов одного вида обьедвмяют. Супернатант, охпаждаемьй до +4-+ осаждают 98%-ной уксусной кислогой при рН 4,0-4,2. После вьшерживания подкисленного супернатанта ори в течение 24-48 ч, осадок отделяют центрифугированием при 5000-вООО об/мйн в течение 15 мин. Надосадочную жидкость осторожно сливают. Осадок дважды отмьшают охлажденным до С фиэиолб1 ическим раствором с ,04,2, затем растворшот боратнобуферным раствором с ,0-7,2, который добавляю из расчета l/lOO-l/500 относительно объема осажденного супернатанта доводят а97,5-7,8 добавлением ЗО%-ного раствор МаОН и оставляют в холодильнике при +4-+7°С на 24-48 ч. затем препарат подвергают гель-хроматографии на колон ке с сефадексом Г-5О .или молселектом. Фракция, очищенная от иммунологически инертного балласта, элюируется под конт ролем спекгрсфотометрии при 280 им в виде первого пика, соответствующего свободному объему геля. Препарат стери лизуют автоклавированием при 110 С в течение ЗО мин. После проверки стерильности и безвре ности препарат разводят на кожные дозы по содержаншо единиц белкового азота (0,1 мг белкового азота соответствует 10.000 Р МИ). Содержание Р NH в 2 мл и степень специфической активности для каждого вида аллергена регламентированы действующими ТУ. Специфическую активность разведенного аллергена проверяют методом внутрнкожных проб на больных с инфекционно-аллергическими заболеваниями, tlpи которых возможна сенсибилаза- ция к данному виду микроорганизмов. Пример. Получение аллергена кишечной палочки. В качестве исходного продукта для получения очищенного аллер гена кищеЧной палочки используют концентрированный маточньй аллерген двух штаммов кишечной палочки (штамм №Ns 2-ЧП и 1-6 .), который является основой препарата диагностического алле гена кишечной палочки. Культуры вьфащ вают 6 суток при +37 С на жидкой пита тельной среде, состоящей из одной части бульона Мартена и двух частей бутона Хоттингера. Бульсмную культуру подвергают центрифугированию в течение 1 ч При 3000 об/мин. Супернатант сзсаждают 98%-ной уксусной кислотой при рН - 4,0 4,2. Осадок отделяют центрифугированием на холоде в течение 15 мин при 5000 об/мин. Надосадочную жидкость сливают, а осадок отмывают охлажденным до +4.ь7 С физиологическим раствором с рН 4,О-4,2, а затем растворяют баратнобуферным раствором с ,О-7,2, из расчета 1/100 исходного обьема супернатанта. После тщательного перемешивания рН доводят до 7,0-7,2 добавлением 30%-ного раствора МаОН. Препарат подвергают хроматографии на колонке с гелем сефадекса Г-50. Свободньй объем колонки предварительно определяют при помощи элюирования высокомолекулярного соединения (голубой декстран Т-2000). На колшку размером 25х8ОО мм наносят Юмл препарата и проводят элюирование боратно-буферным раствором при рН 7,2. Пробы элюата объемом 5-6 мл объединяют под контролем спектрофотометр ИИ при 280 нм. Для колонки с гелем сефадекса 25х X 800 мм свободный объем составляет SO-SS МП. Фракцию 1 стерилизуют автоклавированием при НО С в течение 30 мин. Препарат проверяют известными способами на стерильность и безвредность определяют содержание единиц белкового азота. Стандартизируют препарат в кож- . ных диагностических дозах. За 1 диагностическую дозу принимают разведение аллергена с наименьшим содержанием (400 PN И в 1 мл) белкового азота, вызвавшее положительные внутрикожные реакции у МО-60% больных с инфекцион- но-аллергическими заболеваниями, в патогенезе которых имеет значение сенсибилизация к кишечной палочке (хронические заболевания желудочно-киыечного тракта . с аллергическим компонентом). С фракцией 1 выходит около 5О% белка, содержащегося в цельном препарате. Основу фракции 1 составляют белковые компоненты с молекулярньпл весом более 30.000 (80-85%), связаннью с небольшим количеством углеводов (5-8%), нуклеиновых кислот (6-12%) и липидов (0,5-1%). Практически все антигены элюировались Б составе фракции 1 (мол.вес ЗО.ООО), последующие фракции (мол.вес 30.000) бъши иммунохимически инертныфракция ИГ, или слабо активны - фракция II. При внутрикожном тестировании на морских свинках, сенсибилизированных к цельHOMj аллергену кишечной аалоч1 И, почти вся активность была связана с фракцией

Используя предлагаемый способ были получены очищенные раствоимые аллергены золотистого стафилококка, стрептококка группы А, кишеч1аой палочки и протея мирабилнс.

При испытании этих аллергенов в клинических условиях установлена их высокая специфическая активность при значительно меньшем, по рравнению с коммерческими препаратами, . содержаний белка в 1 кожной дозе препарата. Для аллергена золотистого стафилококка содержание белка в 1 кожной дозе снижено в 4 раза, для аллергена стрептокок ,ка группы А -i в 6 раз, для аллергена кишечной палочки и для аллергена протея мирабилис - в 2 раза.

Предлагаемый способпозволяет получать более стандартные препараты бактериальных аллергенов, используемых в практике здравоохранения.

Формула изобретения

Способ получения бактериальных аллергенов путем выращивания микроорганизмов в жидкой питательной среде с последующим отделением биомассы, выделением целевого продук а путем осаждения из надосадочной жидкости, раств эением осадка, его очисткой и стерилизацией, отличающийся тем, что, с целью повышения специфичности аллергенов, растворе1шый осадок с помощью гель-хроматографии и выделяют фракции с молекулярным весом выше 30000.

Источники информации, принятые во внимание при эксперитзе

1. Справочник по применению бактерийных и вирусных препаратов. М., 1975, с. 56-57.

.8 .097.2.