Способ получения белковых субстра-TOB для ОпРЕдЕлЕНия пРОТЕОлиТичЕСКОйАКТиВНОСТи Советский патент 1981 года по МПК C07K14/76 C07K1/107 C12N9/48 

ют. Выпавший осадок отделяют центрифугированием, насадочную жидкость удаляют, а осадок суспендируют в воде, растворяют добавлением щелочи и осаждают разбавленной соляной кислотой. Осадок отделяют центрифугированием, надосадочную жидкость удаляют, а осадок промывают водой и высушивают лиофилнзированием.

Пример 1. В 660 мл воды суспендируют 40 г кязенната натрия (ч)-. добавляют 0,2-0,3 мл ill. NaOll, перемешивают при комнатной температуре до полного растворения, доводят раствор до рН 11 при по мощи lit. NaOIl. Прнбав.чяют 11,7 г акриламида (ч) и выдерживают раствор при 50°С в течение 10 ч, реакционную смесь Оллажда от до комнатной температуры, подкисляют, добавляя по каплям 10% НС до рН 2-3. Выпавший осадок отделяют центрифугированием. Надосадочную жидкость удаляют, а остаток растворяют, добавляя по каплям к 200 мл образовавшегося раствора 1 н. NaOH и осаждают, добавляя 10% НС1 до рН 2-3. Полученную смесь центрифугируют. Надосадочную жидкость удаляют, а осадок высушивают лиофилизированием. Получают 27 г белка порошка.

Пример 2. В 250 мл воды добавляют 10 г яичного альбумина и растворяют при перемешивании. При помощи 1н. , NaOH доводят рН до 10. Прибавляют 3 г акриламида и выдерживают раствор при 50°С в течение 7 ч. Реакционную смесь охлаждают до комнатной температуры, подкисляют добавлением 10% НС1 до рН 4-5. Выпавший осадок отделяют центрифугированием, надосадочную жидкость удаляют, а исадок суспендируют в 100 мл воды, растворяют, добавляя по каплям 1 н. ii осаждают, добавляя 10% НС1 до рН 4-5. Полученную смесь центрифугируют. Надос,-1мочную жидкость удаляют, а осадок высушивают лиофилизировапием. Получают 7 г белого порошка.

Пример 3. Методика определения протеолитической активности. В две пробирки вместимостью 20-25 мл наливают 1 мл 0,5%-ного раствора выше описанного субстрата в 0,1 М универсальном буфере, рН 7,2 и термостатируют в ультратермостате npii 30°С 5 мин. В одну п|)обирку приливают 1 мл ферментного раствора в универсальном буфере, рН 7,2, а в другую - 1 мл инактивированного ферментного раствора (контроль) и инкубируют при 30°С 10 мин, после чего переносят обе пробирки в кипящую водяную баню и выдерживают в ней 5 мин. В охлажденные до ко лнатной температуры пробирки с инкубачионноГ; смесью прнливают по 9,4 мл обратного буфера, рН 9,3 и по 0,6 мл 0,03 М jiacTBOра 2, 4, 6-тринитробензолсульфокислоты, энергично взбалтывают реакционную смесь и выдерживают в термостате при 30°С

40 мин, после чего определяют оптнческую плотность опытного раствора на фотоэлектроколориметре ФЭК-56М (4 фильтр) или,на спектрофотометре при 420 нм против контрольной пробы (с инактивированным ферментом) в кюветах с толщиной ноглощающего слоя 10 мм.

Протеоли.тическую активность (ПА) вычисляют по формуле: Д12

ПА

1000 мг .

ГЭ- 10-м

где Д - оптическая плотность;

12 - разведение ферментного раствора в ходе определения; ГЭ - глициновый эквивалент, определенный по г)адуировочной кривой;

10 - время гидролиза субстрата, мин; М - количество ферментного препарата, взятого на нротеолиз, мг/мл;

1000 - переводной коэффициент полученных единиц на 1 г ферментного препарата.

Результаты определения. По вышеуказанной методике проведены 4 серии определений протеолитической активности. Результаты приведены в таблнце

Блокирование аминогрупп акриламн.ом обеспечивает следующие преимущества.

1.Получают субстраты намного дещевле изготовляемых за рубежом модифицированных восстановительным метилированием белков. Например, стоимость 1 г метилказеина фирмы «Серна (ФРГ) - 12,8 валютных рублей I категории, а ориентировочная цена казеина, модифицированного акриламидом, 0,5-1,0 руб. за 1 кг.

2.Изготовление субстраты обладают хорошими физико-химическими свойствами. При модификации белков акриламидом вводят полярные CH2CH2CONH2 группы и таким образом улучщается растворимость в воде. Это позволяет быстро приготовлять растворы модифицированных белков в широком диапазоне концентрацией.

Формула изобретения

1. Способ получения белковых субстратов для определения протеолитической активности путем блокирования амино65 групп белков, отличающийся тем, что.

5€

е удешевления субстратов и улуч-. Источники информации,

«(.исния их растворимости в воде, блокиро-принятые во вниыаиие при экспертизе тзание аминогрупп проводят действием акриламида в водиой среде ири 45-55°С и

рН 10-11.5 1. Л. Lin, С. Е. Means and R. Feenly

2. Способ по п. 1, отличающийся«The action of proteolytic enzymes on

тем, что, применяют 20-30% акриламидаN, N - dimetil proteins Л. Biol. СЬеш.

,OT веса модифицированного белка.244, 789-793, 1969 (прототип).

810722