Способ определения протеолитической активности ферментов Советский патент 1982 года по МПК C12Q1/38 G01N33/68 

.. I. . Изобретение о-гаосится к биохимии, а именно к способам определения активное ти ферментоэ,.:; Известен способ определенияпротеопи тической активности (ПА) ферментов из тем изменения к(1ичества прогидропизо ваннык Пептидных связей, включающий подготовку пробы, инкубацию субстрата с ферментом пробы,-обработку анализируем мой пробы реагентом и спектрофотометри рованкв1. . Недостатком этого способа является : низкая скцэость образования окрашенно гО продукта взаимодействи-я тринитробен зопсульфокислбты с аминогруапамв гвдролизата. Вследствие этого, продолжи тельность определения аротеопитической активности составляет 1-2 ч. Цель -изобретения - сокращение прсьдолжительности определения. Поставленная цель достигается тем, что соглаою способу определения проте олитйчёской активности ферменте путем измерения количества прогидролизованньк Пептидных связей, включающий подготовку пробы; обработку анализируемой пробы реагентом и спектрофОтометрирование, в качестве реагента используют о -фталё-, вьй реагент и анализируемую пробу обрабатьюаютреагентом при рН 7,5-1О. В качестве О-фтаЛевого реагента используют раствф о-фталевого альдегида в концентрации 0,04-0,12 мг/мл и меркаптоэтшола в концентрации 0,2 0,2 мг/мл в боратнОм буфере. П р и м е р . Приготовление о-фталевого реагента. В мерную колбу емкостью 20О мл приливают 2 мл этанопьного растворе. о-фталевого альдегида ксшцентрации 1О мг/мл и 1 мл этанольного раствора меркаптоэтанопа концентрации 5 мл/100 swi и доводят до метки 0,1 М ёорётньлм буфером рН 9,3. Определение активности нейтральной протеазы из протосубтилин ГЗХ. В 50 мл 0,1 М универсального буфера рН 7,2 растворяют 1 г протосубтилинаГЗХ в готовят разведение 5 мл/ 59 мл. Концентрация ферментного раст:Вора 2 мг/мл. 1,5 г белкового субстрата раствсч5яют в 2ОО мл ОД М универсального ёуфера рН 7,2. Белковьй5 субстрат готовят по способу Г. И. Дениса н др. ts 3 . В 2 пробирки наливают по 1 мл попученного 0,75%-ного раствс ра субстрата, термостатируют при 5 мин. В одну пробирку приливают 1 мл

ферментнот-о раствора, а в другую - 1 Цп ннактйвдгЬванного кипячением ферментного раетйорап(контроль) и инкубируют фи ЗОс 10 мин,, после чего вьшержива ют обе пробирки в кипящей водяной бане 5 Д мин. В пробирки припивают по Ю мл о-фталевого реагента, взбалтывают и В1 ьдерживают при 30с ,15 мин, после чего определяют оптическую плотность раствора на спектрофотометре при 340 нм 30 против контрольной пробы (с инактнвирован- ным ферментом).

Протеолитическую активность в ед/г вычисляют по формуле:

ответствующая 1 мм глиаина), в данном случае ГЭ-2,8; УИ - количество ферментеого препарата, взятого на протеопвз в . мг;

/fOOO - переводной коэффициент попучев ных единад на 1 г ферментного препарата.

Оптическая плотность 0,440. Протеолитическая активность 94 ед/г.

За единицу активности принимается такое количество фермента, которое за 1 мин при образует 1 .ммоль свободньк . аминогрупп..

I

При использхюании предлагаемого способа определения протеолитвческЫ) активности продолжительность определения сокращается от 1-2 ч до 35 мин. Это создает экономию рабочего времени.

Линейный характер зависимости оптической плотности от концентрации фермен та сохраняется .в широком интервале Таким образом, разброс результатов в параллельных оаределениях ПА соответ. ствует среднему значению коэффициента вариации 1,4% для метода, основанного на применении о-фталевого альдегида в.1,6% для метода. основанаого на применении 2,4,6 1триниаро6ензолсульфокисло1ГЫ Точность первого метода несколько выше. 1 ормула изобретения 1. Способ определения протерлитичеокой активности ферментов путем измерения количества прогидролизованных пептидных связей, включаЕОщий подготовку (фобы, инкубацию субстрата с ферментом пробы, обработку анализируемой ,пробы реагентом и спект)офотометрирование. отличающийся тем, что, с целью сокращения продолжительности определения, в качестве реагента исаопьзуют о -фталевый реагент и аналвзируе 4ую .пробу обрабатывают реагентом при рв 7,5-10. 2. Способ по п. 1, о т л и ч а ю - щ и и с я тем, что в качестве о-фталево го реагента используют раствор о «фтале г вого альдегида в квнцентравии О,04Ю,12 мг/мл и меркаятоэтанола в концен- 1рации 0,2 мг/мл в боратеом буфере. Источники информации, принятые во внимание аре экспертизе l.X&ioe.., 244(4), 1969, 789793. 2. Авторское свидетельство СССР ао заявке № 2653395, от 15.О8.78.