Ферментный электрод для опреде-лЕНия глюКОзы Советский патент 1981 года по МПК G01N27/46 

Изобретение относится в аналитической биохимии и может быть использовано в научно-исследовательской работе, пищевой и микробиологической промыиленности, бродильном произведстве, клинических исследованиях. Известен фенментный электрод для определения глюкозы, содержащий электро и полупроницаемую мембрану, между которыми содержится нативная или иммобилизованная глюкозооксидаза В качестве акцепторов электронов используют хинон или ферроцианид, добавляемые в измерительную ячейку. Концентрацию глюкозы определяют по скорости ферментативной реакции, регистрируя величину тока окисления восстановленного акцептора, образующегося в результате ферментативного процесса D-l ; .

Однако используег 1е акцепторы низкомолекулярны и не могут находить ся в реакционной зоне за полупроницаемой мембраной и, следовательно, 1таходятся ,в исследуемой системе. Нет достаток существенно сужает область применения данного устройства, которое преимущественно используют для анализа дискретных проб.

Наиболее близким по технической сущности и достигаемому эффекту к предлагаемому является ферментный электрод, содержащий индикаторный электрод, глюкозооксидазу и полупроницаемую мембрану. Измерение скорости ферментного процесса регистрируют по величине тока восстановления кислорода на кислородном электроде.

-Такое устройство обладает тем преимуществом, что протекание реакции и нужный аналитический сигнал обеспечиваются легко диффундирующим через мембрану кислородом, растворенным в исследуемом образцу, находящимся в контакте с воздухом, и не требует использования искусственных акцепторов электронов fz .

Недостатком такого устройства является невозможность проведения анализа в бескислородном растворе и плохая воспроизводимость аналитического сигнала при проведении реакции в токе раствора с изменяющимся содержанием растворенного кислорода, например, цельной крови. Действительно, согласно законам ферментативной кинетики скорость ферментативной реакции прямо пропорциональна концентрации глюкозы и кислорода, если последние находятся в концентрациях ниже соответствующих значений величин константы Михалиса (К). Растворимость кислорода при нормальных условиях 240 мЛМ несколько ниже К глюкозооксидазы, для кислорода 820 мкМ. Следовательно, при фиксиро ванной концентрации глюкозы и переi менной концентрации кислорода ферментный электрод обеспечивает ложны аналитический сигнал. Цель изобретения - возможность проведения анализа глюкозы безреагентным способом в бескислородных жидкостях и повышение надежности из мерений при анализе глюкозы в токе раствора с изменяющимся содержанием растворенного кислорода. Поставленная цель достигается те что пространство в ферментном элект роде между электрохимическим датчиком и полупроницаемой мембраной содержит раствор глюкозооксидазы и окислительно-восстановительный поли мер, содержащий в основной или боко вой цепи субстраты-акцепторы глюкоз оксидазы в насыщающих для глюкозооксидазы концентрациях, например, хинон или виологен. Отличительной чертой устройства является то, что оно содержит в качестве акцепторов электронов окисли тельно-восстановительный полимерный субстрат, Устройство работает следующим образом. Глюкоза образца диффундирует через мембрану в реакционную зону фер ментного электрода, где. протекает р акция . Механизм реакции окисления О-глю козы под действием глюкозооксидазы следующий . глюконо-б-лактон+Е Н О-глюкоза+Е il 0 и EH,j где Е окисленная и восстановленная форг/и фермента;V окисленная и восстано ленная форма акцепторов электронов. Окисление восстановленной формы глюкозооксидазы происходит под действием полимерного акцептора, легко удерживаемого как и фермент в реакционной зоне полупроницаемой мембра ной . О концентрации глюкозы судят либ по начальной, скорости ферментной ре акции - по скорости увеличения тока окисления накапливающейся восстанов ленной формы полимерного акцептора на графитовом электроде, либо по ст ционарным -значениям тока окисления Пример 1. В пространство между графитовым электродом и полупроницаемой мембраной помещено 10 м раствора полибензилвиологена в концентрации SlO - м и 10 мкл раство ра глюкозооксидазы в концентрации 10 М. Ферментный электрод помещают в 1 мл ячейку, содержащую бескислородный фосфатный буферный раствор рН 7,6 и, добавляя, стандартные количества 56 мкл калбированных раствором глюкозы, измеряют стационарные значения тока окисления полибензилвиологена при потенциале 0,2В(НКЭ). Концентрация глюкозы в калиброванных растворах от 25 - 400 мг%, На основании полученных данных строят калибровочный график зависимости стационарных значений тока окисления полимера от концентрации глюкозы. Пример 2, Аналогично примеру 1, но вместо полибензилвиологена, используют раствор полихинона в концентрации М. На графитовой электрод подают потенциал 0,4 В (НКЭ) Использование предлагаемого устройства ферментного электрода для определения глюкозы обеспечивает по сравнению с известным следующие технико-экономические преимущества: позволяет проводить анализ глюкозы безреагентным способом в бескислородной, среде; повышает надежность получения достоверных данных о концентрации глюкозы в токе растворов с изменяющимся содержанием кислорода, например, в токе цельной крови и может быть использовано при проведении процессов ферментации в микробиологической промышленности, в бродильном производстве, в фармацевтической промышелнности, в научных исследованиях, преимущественно для анализа глюкозы в Протоке сложных по составу жидкостях, например, в токе цельной крови, что важно при проведении большого числа хирургических операций. Решение задачи по созданию искусственной поджелудочной железы и автоматического регистрирующего дозатора инсулина, имплантируемого больным диабетом. Формула изобретения Ферментный электрод для определения глюкозы, содержащий индикаторный электрод, полупроницаемую мембрану и раствор глюкозооксидазы, отличающий ся тем, что, с целью расширения функциональных возможностей устройства и повышения точности измерений в растворах с изменяющимся содержанием кислорода, пространство между индикаторным электродом и полупроницаемой мембраной заполнено раствором глюкозооксилазы и окислительновосстановительным полимером, содер- жащим в основной или боковой цепи субстраты-акцепторы глюкозоо ссидазы в насыщающих для глюкоэооксидазы концентрациях.. Источники информации, принятые во внимание при экспертизе 1. Патент США W 3838033, кл..204-195, опублик. 1973. 2. Патент США № 354662, кл. 204-195, опублик. 1972 (прототип),