Способ получения фосфатидилглицерина Советский патент 1981 года по МПК A61K31/6615 C07F9/10 

(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ФОСФАТИдаЛГЛИЦЕРША

Изобретение относится к химико-фар мацевтической промьшленности. Известен способ получения фосфатидИлглицерина путем действия фосфолип зы Д на лецитин в присутствии глицери на с последующей очисткой колоночной хроматографией 1. Однако при этом способе выход фосфатидилглицерина незначителен и соста ляет 25%, чистая фосфатидная кислота не выделяется. Цель изобретения - повышение выхода целевого продукта и одновременное получение фосфатидной кислоты. Поставленная цель достигается тем, Что лецитин растворяют в диэтиловом эфире, полученную фракцию обрабатывают трилоном Б и злюирование проводят смесью хлороформ-метанол в соотношении 94:6 в присутствии аммиака для получения фосфатидилглицерина и при элюировании смесью хлороформ-метанол в соотношении 6:4 вьзделяют фосфатнд кую кислоту. Пример 1. Препарат фосфолипазы Д готовят гомогенизацией капусты с 0,05 М натрий-ацетатным буфером рН 5,6. Соотношение ткань-буфер 1:3. Полученный зкстракт центрифугируют при 5000 об/мин 15 мин. Надосадочную жидкость используют в качестве препарата фосфолипазы Д. Ферментативную смесь готовят путем растворения 1,5 г чистого лецитина в 300 мл дизтилового эфира (5 мг/мл), смешивают с 300 ил 0,05 М натрий-ацетатного буфера рН 5,6, с 300 мл препарата фосфолипазы Д, 600 Ь4Л 0,02 М раствора хлористого кальция,и 600 мл глицерина. Реакцию проводят П1 26 С 0,5 ч при постоянном перемешивании. Б ходе реакции расщепляется около 95% лецитина. Соотношение фосфатидилглицерина и фосфатидной кислоты около 3:1. Полученная фракция содержит фосфатидную кислоту, около 22%, лецитин около 5%, фосфатидил3глицерин около 63%, фосфатидилметанол около 3%, и нефосфолипидные примеси около 7%, Фракцию фосфатидилглицерина и фосфатидной кислоты извлекают 4 раза сис темой хлороформ-метанол 2:1, одной третьей частью от реакционной смеси каждый раз. Хлороформ-метанольньй слой упаривают до 50 мл, прибавляют 50 мл 2%-ного раствора трилона Б в системе вода-метанол 9:1, тщательно перемешивают, центрифугирзпот и верхний слой отбрасывают. Нижний слой отмывают 30 мл дистиллированной воды .от избытка трилона Б. Водный слой отбрасывают, нижний упаривают досуха и растворяют в 10 мл хлороформ-метанола 94:6 с добавкой 25% водного аммиака (3 мл/л системы). Фракция готой к нанесению на колонку. Для разделени 1 г смеси веществ используют 50 г силикагеля Л 40/100А. Силикагель суспензируют в хлороформ-метаноле 94:6 с добавкой 25% водного аммиака. (3 мл системы) и загружают в колонку диаме ром 4,5 см с высотой адсорбционного столба 10 см. Отношение диаметра к высоте адсорбционного столба 1:2. Дня элюирования используют: 1.4л хлороформ-метанола 94:6 с добавкой 25% водного аммиака (З мл /л систеьвл). Вымывают нефосфолипидны примеси и фосфатидилметанол. В после нем литре системи заметно появление фосфатидилглицерина; 2. л хлороформ-метанола 92:8 с добавкой 25% водного аммиака (4 мл /л системы). ВьцФюают хроматографиче ки чистый фосфатидилглицерин. В riepвом литре системы заметно небольшое количество фосфатидилметанола, в последних полутора литрах появляются следы лецитина. 3.3л хлороформ-метанола 7:3 с добавкой 25% водного аммиака (6 мл/л системы). Bы BlIвaют лецитин. В последних полутора литрах выходит лецитин с примесью фосфатидной кислоты 4. 1,5 л хлороформ-метанола 6:4. Вымывают хроматографически чистую фосфатидную кислоту. Из 1 г фракции фосфатидилглицери на и фосфатидной кислоты получают сразу 376 мг (около 60%) хроматогра фически чистого фосфатидилглицерина и 300 мг с примесью фосфатидилметан ла и лецитина, полученных в начале и конце второй системы. Их доочистк 94 на аналогичной колонке дает еще 150 мг хроматографически чистого фосфatидшIглицepинa. Конечный выход хроматографически чистрго фосфатидилглицерина составляет около 84% от исходного фосфатидилглицерина после ферментолиза. Выход хроматографнчески чистой фосфатидной кислоты составляет 130 мг (около 60%). Пример 2. Препарат фосполипазы Д готовят гомогенизацией семян арахиса с дистиллированной водой. Соотношение ткань-вода 1:3. Полученный экстракт центрифугируют при 5000 об/ /мин 15 мин. Надосадочную жидкость используют в качестве препарата фосфолипазы Д. Ферментативную смесь готовят растворением 1,5 г лецитина Олайне ;(смесь лецитина, сфингомиэлина, лизолецитина, фосфатидилзтаноламинаи нейтральных липидов) в 300 мл диэтилового зфира 5 мг/мл, смешивают с 300 мл препарата фосфолипазы Д, |300 мл дистиллированной воды, 600 мл, 0,02 М раствора хлористого кальция и 600 мл глицерина. Реакцию проводят при 37 в течение 1 ч при постоянном перемешивании. В ходе реакции расщепляется около 90 возможных предшественников фосфатидилглицерина и фосфатидной кислоты. Полученная фракция содержит фосфатидную кислоту 14,2%, сфингомизлин 2,6%, лецитин 10,7%, фосфатидилглицерин 50,1%, фосфатидилэтаноламин 3,0%, фосфатидилметанол 3,1%, лизолецитин 0,6%, фосфатидилинозит 2,6%, нефосфолипидные примеси 13,1% Обработку полученной фракции трило-, ном Б и подготовку колонки проводят по примеру 1.Для элюирования используют: 1.5л хлороформ-метанола 94:6 с добавкой 25% водного аммиака (3 мл/л системы). Вымывают нефосфолипидные примеси и фосфатидил-метанол. В последнем литре системы заметно появление фосфатидилглицерина. 2.9л хлорйформ-метанола 92:8 с добавкой 25% водного аммиака (4 мл/л системы). Вымывают хроматеграфически чистый фосфатидилглицерии. В первом литре систекы -заметно небольшое количество фocфaтидилмeтaнoлa в последнем литре появляются следы фосфатидилэтaнoлaминai3.4л хлороформ-метанола 7:3 с д бавкой 25% водного аммиака (б мл/л системы). Вымывают фосфатидилэтанол амин, лецитин, сфингомиэлин, фосфати дилинозит со следами фосфатиДной кис лоты в конце систеьол. 4.1,5л хлоррформ-метаиола 6:4. Вымывают хроматографически чистую фосфатидную кислоту. . Из 1 г фракциифосфатидилглицерин и фосфатидной кислоты получают сразу 320 мг (около 64% ) хроматографически чистого фосфатидилглицерина и 280 мг с примесью фосфатидилметанола и фосфатидилэтанойамина, полученных в начале и конце второй системы. Доочистка последней на сходной колонке дает еще 140 мг хроматографически чистого фосфатиднлглицерина. Конечный выход хроматографически чистого фосфатидилглицерина составляет около 92% от исходного фосфатндилглицерина после ферментолиза. Выход хроматографически чистой фосфатидиновой кислоты составляет 92 мг (около 65%). Пример 3. Препарат фосфоли;пазы Д готовят по nproiepy 2. Ферментативную смесь готовят растворением 1,5 г лецитина Олайне jtсмесь лецитина, сфингомизлина, лизо/леЦитина, фосфатидилэтаноламина и (нейтральных липидов) в 300 мл диэтил| вого зфира 5 мг/мл, смешивают 300 мл препарата фосфолипазы Д, 300 мл дистиллированной воды, 600 Мл 0,02 М .раствора хлористого кальция и 600 мл глицерина. Реакцию проводят при 37 в течение 1 ч при постоянном перемешивании. В ходе реакции расщепляется около 95% возможных предшественников фосфатидилглицерина и фосфатидной кислоты. Полученная фракция содержит, фосфатидную кислоту 12,2%, фосфатидил глицерин 43,4%, лецитин 4,4%, сфингомиэлин 2,6%, фосфатидилметанол 2,2% фосфатидилэтаноламин 3,4%, фосфатидил инозит 2,7%, лизолецитин 0,4% нефосфо липидные примеси 27,8%. Обработку полученной фракции трилоном В и подготовку колонки проводят по примеру 1. В отличие от последнего изменено соотношение диаметра 2,2 см к высоте адсорбционного столба 22 см до 1:10. Для элюирования используют: 1 . 2,7л хлор.оформ-метанола 94:6 с добавкой 25% водного раствора аммиака (З мл/л системы). Вымывают нефосфолипидные примеси и фосфатидилметанол. В последнем литре системы заметно следовое количество фосфатидилглицерина. 2.6 л хлороформ-метанола 92:8 с добавкой 25% водного аммиака (4 мл/л системы). Вымывают хроматографически чистый фосфатидилглицерин. В последнем литре системы идет смесь фосфатидилглицерина и фосфатидилэтаноламина в незначительном количестве 3.3 л хлороформ-метанола 7:3 с добавкой , 25% водного раствора аммиака (6 мл/л системы). Вымывают фосфатидил з т ноламин, фосфатидилинозит, лецитин, сфингомизлин. В конце -системы появляется следовое количество фосфатидной кислоты. 4.1,5 л хлороформ-метанола 6:4. Вымывают кроматогра шчески чистую фосфатидную кислоту. Из 1 г фракции фосфатидилглицерина и фосфатидной кислоты получают сразу 350 мг (около 80%) хроматографически ;чистого фосфатидипглицерина и 100 мг с примесью фосфатидилметанола и фосфатидил этанол амина, полученных в на«чале и конце второй системы. Доочистка последней на сходной колонке дает еще 50 мг хроматографически чистого фосфатидилглицерина. Конечный выход хроматогра4«чески чистого фосфатидилглицерина составляет около 92% от исходного фосфатидилглицерина после ферментолиза. Выход хроматографически чистой фосфатидной кислоты составляет 77 мг (около 63%). Использование предлагаемого спосоаа по сравнению с известными способами, позволяет быстро, просто, с экономной затратой растворителей одновременно получить хроматографически чистые фосфатидилглицерин и фосфатидную кислоту с высоким выходом 84-92% фосфатидипглицерина и 60-65% фосфатидной кисоты. Формула изобретения Способ получений фосфатидилглицериа путем действия фосфолипазы Д на ецитин в присутствии глицерина с оследующей очисткой колоночной хроатографией, отличающийся ем, что, с целью повышения выхода елевого продукта и одновременного поучения фосфатидной кислоты, лецитин

1 8311298

растворяют в диэтиловом эфире; полу-нии 6:4 вьщеляют фосфатидную кислоту. ченную фракцию обрабатывают трилоном

Б и элюирование проводят смесью хло-Источники информации,

роформ-метанол в соотношении 94:6 впринятые во внимание при экспертизе

присутствии аммиака для получения5 1. М. НеПег. Phosphol Ipase Din

фосфатидилглицерина и при элюированииpeanut seeds Bull, Sol Chim Biol.

смесью хлороформ-метанол в соотноше-.1968, 50, 9, 1395-1409.