Способ количественного определения рибонуклеозидов Советский патент 1979 года по МПК G01N31/16 

Изобретение относится к аналитической химии, а именно к способам количественного, определения рибонуклеозидов. Известен способ количественного определения рибонуклеозидов, заключающийся в том, что анализируемую пробу окисляют избытком йодной, кислоты с последующим потеициометрическим титрованием в водной среде раствором щелочи. Недостатками способа являются невысокая точность и ограничеиность применения, т. е. невозможность аиализировать рибоиуклеозиды в смеси {I}.. По технической сущности и достигаемому результату к предлагаемому способу наиболее близок способ количественного определения рибонуклеозидов путем окисления анализируемой пробы избытком йодной кислоты, восстановления полученного раствора йодидом калия с последующем титрованием тиосульфатом 2. Недостатком способа является невозможиость определения рибонуклеозидов в смеси с дезоксинуклеозидами, замещенными иуклеозндами и основаниями нуклеиновых кислот. Целью изобретения является возможность определения рибоиуклеозйдов в смеси с дезоксинукл зндамн, замещеиными нуклеозидами и основаниями нуклеиновых кислот. Цель достигается описываемым способом количественного определения рибонуклеозидов, заключающимся в окислеиии анализируемой пробы избытком йодной кислоты, восстановлении полученногч раствора глюкозой с последующим добавлением к образовавшемуся раствору органического растворителя - диметилформамида или .диметилсульфоксида, или формальдегида, или метилцеллозольва до объемного соотношения вода юрганический растворитель 1:1-5 соответственно и титрованием щелочью. Отличительными признаками способа являются восстановление глюкозой, добавление к восстаиовлеиному раствору Органического растворителя - диметилформамида или днметилсульфоксида, или формальдегида, или ыетилцеллозольва до объемного соотношения водагорганическйй растворитель 1:1-5 соответствепно и титрование щелочью.

Положительный эффект достигается прибавлением глюкозы именно после окисления а -гликолевых групп анализируемой пробы избытком йодной кислоты. Глюкоза взаимодействует с остатком йодной кислоты, восстанавливает ее избыток до йодноватой кислоты и выделяет при этом муравьиную кислоту.

Введение глюкозы обеспечивает выделение муравьиной кислоты в количестве, соответствующем количеству йодной кислоты. Найдено, что муравьиная кислота количественно выделяется при повышенной температуре, причем оптимальной является температура 50-бО-С.

Органические растворители значительно увеличивают диффереицкрующее действие воды и обеспечивают, дифференцированное титрование йодноватой и муравьиной кислот н кислотных групп рибонуклеозкдов. Раздельное титрование осуществляют при объемном соотношении вода:органический растворитель 1:1-о. При более инзких соотношениях дифференцирование не достигается, а при более высоких выпадает осадок. В качестве органических растворителей используют метилцеллозольв, диметилформамид, диметилсульфрксид и др. Прибавление их после обработки раствора анализируемой пробы йодной кислотой не приводит к положительному эффекту, так как восстановление йодной кислоты в водяо-органическйх растворах протекает медленно.

Предлагаемым способом содержание рибонуклеозидов определяют одновременно по двум группам -- в-гликолевой группе пурииового или пиримидинового гетероцикла. Это позволяет раздельно анализировать смеси рибонуклеозидов с соединениями, которые содержат только гликолевую или только кислотную группу, т. е. с дезоксинуклеозидами, замещенными нуклеоэндами, основаниями нуклеиновых кислот и другими пуринами и пиримидинами.

Таким образом, предлагаемый способ заключается в следующем.

Навеску анализируемого вещества (0,050,30 г) растворяют в 2 мл воды или водного раствора формальдегида, точно измеряют и к раствору навески прибавляют 1-5 мл 0, М водного раствора йодной кислоты. Раствор выдерживают при комиатной температуре 15-20 мин. Затем к анализируемому раствору прибавляют 1-2 мл насыщенного раствора глюкозы, нагревают полученную смесь до 50-60°С н выдерживают 15-20 мин. После этого добавляют 10- 50 мл органического растворителя, погружают стеклянный и каломельный электроды и проводят потенциометрическое титрование водным раствором щелочи. Параллельно при готавливают, выдерживают и титруют расгвор без навески пробы, т. е. проводят холостой опыт. Иа кривой титрования анализируемого ластвора появляются два или три

скачка потенциала: первый соотнетствует оттитрованию йодноватой кислоты, второй - муравьиной кислоты, а третий - кислотной группы пуринового или пиримидииового цикла. На кривой титрования холостого раствора два скачка потенциала - первый соответствует оттитрованию йодноватой кислоты, второй - муравьиной кислоты.

На чертеже изображены кривые потенциометрического титрования, где:

1- кривая титрования в холостом опыте;

2- кривая титрования при определении аденозина (пример 1);

3-кривая титрования при определении инозина (пример 2);

4- кривая титрования при определении смеси аденозин + инозин (пример 3);

5- кривая титрования при определении смеси 5-бромуридин 5-бромурацил (пример 4).

Пример /..Определение аденозина.

Навеску аденозина (0,0983 г) растворяют в 2 мл воды. К раствору приливают 5 мл 0,2 М раствора йодной кислоты. Таствор оставляют при комнатной температуре на

5 15 мин. Затем к анализируемому раствору прибавляют 1 мл насыщенного раствора глюкозы, полученную смесь нагревают до 50- 60°С и оставляют на 20 мин. После этого добавляют 30 мл метилцеллозольва, при этом достигается объемное соотношение во0 да:метилцеллозольв 1:3,7. Далее потенцнометрически титруют 0,1014 н. раствором гидроокиси натрия в воде. Параллельно проводят холостой опыт. По кривой титрования анализируемого раствора (кривая 2 .на чертеже) находят, что на титрование муравьи3Sной кислоты расходуется 6,05 мл щелочи, а в. холостом опыте - 9,65 мл. Разность составляет 3,6 мл.

Содержание адеиозина в образце состав0 ляет: 100 99%.

Стандартное отклонение ± 0,8%.

Пример 2. Определение инозина.

Навеску инозина (0,1256 г) растворяют в 2 мл воды, к раствору прибавляют 5 мл 0,2 М раствора йодной кислоты и смесь оставляют на 15 мин. Затем прибавляют 2 мл насыщенного раствора глюкозы, полученную смесь нагревают до 50-60°.С и выдерживают 20 мин. После этого добавляют 50 мл 50 диметилсульфоксида, при этом достигается объемное соотношение вода:диметилсульфоксид 1:5. Далее проводят потенцнометрическое титрование 0,1123 н. водным раствором гидроокиси тетрабутиламмония. На кривой титрования появляются три скачка потенциала (кривая 3, см. чертеж). Параллельно проводят холостой опыт. По кривой 2 находят, что на титрование муравьиной кислоты расходуется 5,35 мл титранта, а и холостом опыте - 9,4 мл. Используя разность объемов титрапта (4.05 мл), находят, что содержание инозина составляет . Стандартное отклонение ± l.f/o. По третьему скачку определяют, что на титрование кислотной группы инозина расходуетсн 4,1 мл щелочи. Содержание инозина составляет 98%. Стандартное отклонение ± 0,8%. Пример 3. Определение смеси адеиозина н инозина. Навеску анализируемой смеси , (0.0685 г аденозина н 0,1006 г инозина) растворяют в 2 мл воды, прибавляют 5 мл 0,2 М раствора йодной кислоты и оставляют на 20 мин. Затем приливают 2 мл насыщенного раствора глюкозы, нагревают полученную смесь до 50-60°С и выдерживают 20 мин. После этого добавляют 50 мл диметйлформамида, при этом достигается объемное соотношение водасдиметилформамнд 1:5. Далее проводят потенцйометрйческое титрование 0,1014 н. раствором гидроокиси натрия кривая 4, см. чертеж). На кривой титрования появляются три скачка потенциала, riapav лельно проводят холостой опыт. По третьему скачку на кривой 5 (см. чертеж) находят, что на титрование кислотной группы инозина расходуется 3,7 мл щелочн. Из этих данных а едует, что содержание инозйна в смеси составляет 60%. Стандартное ©тклонение ± 1,0/о. По кривой 4 находят также, что на титрование муравьиной кислоты расходуется 3,4 мл тнтранта, а в холостом опыте - 9,7 мл, т. е. на совместное титрование о -гликолевых групп инозина и аденозина расходуется 6,3 мл титранта. Содержание аденозина составляет « ЗМОШ€7.,0о.. 41% Стандартное отклонение ± 1,6%. Пример 4. Определение смеси 5-бромуридина и 5-бромурацила. Навеску анализируемой смеси 0,П97 г 5-бромурацила и 0,i5iO г 5-бро«урид1ша) растворяют в 2 мл водного раствора формальдегида (формалина), орибавляют 5 мл 0,2М раствора йод1К й кислоты и оставляют на 20 мин. Затем прибавляют 2 мл насыщенного раствора глюкозы, полученную смесь нагревают до Ю-60°С н выдерживают 20 мин. После этого добавлякгг 30 мл диметилсульфоксида, при этом достигается объемное соотношение вода:днметилсульфоксид i:3. .Далее потенциометрнческн титруют 0,1123 н. водным раствором гидроокиси тетрабутиламмония. На кривой титрования появляются три скачка потенциала (кривая 5, см. чертеж). Параллельно проводят холостой опит. По кривой 5 находят, что на тнтройание муравьиной кислоты расходуется 5,4 мл щелочи, а в холостом опыте - 9,5 мл. .Используя разность (4,1 мл), вычисляют, что содержание 5-бромуридина составляет 55%. Стандартное отклонение ± 1,3%. По третьему скачку находят, что на совместное титрование обоих компонентов расходуется 9,6 мл титранта. Содержание 5-бромурацила в смеси составлйеГ 1аб:4|-Ш;Ш123. ( и,2 f ЬЗ Стандартное отклонение ± 1,8%. Пример 5. Определение смеси адекозин э и аденияа. Навеску анализируемой ciyiecH (0,1343 г аденозииа и 0,0668 г адекина) растворяют э 2 мл формалина, прибавляют 5 мл 0,2 М раствора йодной кислоты и оставляют на 5 мин. Затем прнбавлпют 2 мл насыщенного раствора глюкозы, нагревают полученную смесь до 50--бОС и выдерживают 20 мин. После этого добавляют 0 мл дистиллированной воды и 20 мл диметилсульфоксида, при этом достигается соотношение вода:диметилсульфоксид 1:1. Далее проводят потенциометрнческое титрование полученного раствора 0,5038 н. раствором гидроокиси тетраэтиламмоиия. На кривой три скачка потенциала. Параллельно проводят холостой опыт. По третьему скачку на крнвой титрования анализируемого раствора находят, что на титрование аденниа расходуется 4,7 мл титранта. Из данных следует, что содержание аденина в смеси составляет . По кривой находят также, что на титрование муравьиной кислоты расходуется 3,5 мл, а в холостом опыте - 8,4 мл. Исходя из полученных данных, рассчитывают что содержание аденозина в смеси составляет 670/0. В таблице приведены-результаты определения индивидуальных рибонуклеозидов и смеси рибонуклеозидов с дезоксирибонуклеозидамн, замещенными нуклеозидами и нуклеиновыми основаниями.