Способ получения инсулина Советский патент 1978 года по МПК A61K38/28 

(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИНСУЛИНА

Изобретение относится к химико-фар мацевтической промышленности в част ности к получению медицинских препара тов, применяемых в медицинской практике при лечении сахарного диабета. Известен способ получения инсулина путег. экстрации поджелудочной железы подкисленным йодным эталоном,осаждением белковых примесейувакуумдистилляцией экстрактов двойным высаливанием инсулина хлористым натрием,отделен ем белковых примесей при повышении рН раствора до 7,0, изоэлектрическим осаждением и перекристаллизацией целевого, продукта из цитратного буфера. Выход кристаллического инсулина - 2700 ел/кг, активность - 24 ед/мгГЦ. Однако известный с.пособ не обеспечивает высокой частота и выхода кристаллического инсулина. Цель изобретения - повьшение чистоты и выхода кристаллического инсулина. Эта цель достигается тем, что осал дение белковых примесей проводят после первого высаливания хлористым натрием из раствора инсулина-сырца при ,8-3,2 и температуре 3-5с, амор фный инсулин осаждают при концентраци ацетата цинка 0/35-0,5 М на грамм инсулина при рН- 5,2-5,4. П р и м е р 1. 1 кг измельченной поджелудочной железы крупного рогатого скота экстрагируют 3,5 л 82- ного этилового спирта при ,8-3,2 и температуре в течение 3 часов. Экстракт отделяют центрифугированием, а остаток повторно экстрагируют-1,1л 65- ного этилового спирта при рН 2,8-3,2 в течение двух часов. В экстракте 20%-ным растворомNqOH устанавливают рН 3,5 и к нему добавляют 20%ный водный растворСдСЕ(15 мл на 1 л экстракта).Через 10-15 минут устанавливают рН 4,3-4,5 и после сепарирования экстракта упаривают на вакуум в выпарной установке при ,5. Водный раствор обезжиривают и высаливают инсулин 28%-ным водным растворомVoiCf. Получают 1 г инсулина-сырца. 1г инсулина-сьгрца растворяют в 100 мл дистиллированной воды, корректируют рН раствора до 3,05, и раствор выдерживают при температуре- -5с в течение 12 часов. Выпавший осадок отфильтровывают на воронке Бюхнора с добавлением в раствор 10 г кизельгура. В полученном фильтрате устанавливают рН-5,3 и к нему добавляют 3 мл . . раствора ацетата цинка. Рас вор выдерживают при температуре- S c в течение 24 часов, выпавший осгщок .отделяют центрифугированием, растворяют в 40 мл дистиллированной воды, содержащей 520 мг лимонной кислоты. Затем в раствор добавляют 7,2 мл аце тона, О(-72 лмл 5%-ного раствора ацета та цинка и 0,024 мл фенола. Раствор охлаждают ,корректируют рН : 12,5%-ным аммиаком до ,0-8,5„ При перемешивании раствора через 3 минуты корректируют рН до 6,0-6, 2 и раствор при темпвратуре-5-ГС выдержива в течение часов и затем при комнатной температуре в течение 24 часо Выпавшие кристаллы инсулина отделяют центрифугированием, промывают ацетоном, а затем высушивают в вакууме при 20с до постоянного веса. Вы ход инсулина - 3220 ЕД/кг поджелудоч ной железы, активность -25,5 ЕД/мг. Пример 2. Чкстракцию и обработку экстракта до стадии получения инсулина-сырца после первого высалив ния производят, кa описано в примере 1. 1 г инсулина-сырца растворяют в 100 мл дистиллированной воды, вьщерживают при комнатной температуре и перемешивании в течение 2-х часов и затем 10 часов при температуре f-Зс, Выпавший осадок отфильтровывают, а в фильтрате при перемешивании устанавливают ,0, добавляют к раствору 1,5 мл 10%-ного pac.isopa ацетата цин ,ка, и раствор вьщерживают в течение 24 4adoB, Выпавший осадок аморфного инсулина отделяют центрифугированием растворяют в 50 мл дистиллированной воды, содержащей 650 мг лимонной кис лоты, в растврр добавляют 9 мл ацето на, 0,9 мл 5%-ного раствора ацетата цинка и 0,03 мл .фенола. Раствор охлаждают до температуры 1 - 3 С, устанавливают 12,5%-ным аммиаком ,,5 И через три минуты при перемешивании понижают 10%-ной соляной кислотой До ,2 через 20 часов до рН 5,8, Раствор выдерживают при этой температуре, и 9 выпавшие кристаллы инсулина отделяют центрифугированием, промывают ацетоном и высушивают в вакууме при комнатной температуре до постоянного веса, Выход инсулина - 3000 ЕД/кг поджеудочной железы,активность -24,5ЕД/мг. Предлагаемый способ получения инсулина позволяет по сравнению с известным упростить стадию химической очистки инсулина, полученного после первого высаливания (до 2-х операций), более качественно и без потерь инсулина отделить белковые примеси из раствора, количественно выделить инсулин при изоэлектрическом осаждении и кристаллизации, сократить технологический процесс на 120 часов ( в расчете на 1 миллион единиц инсулина), повысить выход инсулина с 2700 до 3200 ЕД/кг поджелудочной желегы, а также его чистоту (снижение интенсивности полос белковых примесей на электрофореграммах электрофореза в полиакриламидном геле).. Формула изобретения Способ получе-ния инсулина путем экстракции поджелудочной железы подкисленныгл водным этанолом : осаждением белковых примесей, вакуу1№ис.тилляцией экстрактов, двойным высаливанием инсулина хлористым натрием; отделением белковых примесей при повышении рН раствора до 7,0.|Изоэлектрическим осгждением аморфного инсулина и перекристаллизацией целевого продукта из цитратного буфера, отличают и й-: с я тем, что, с целью повышения чистоты и выхода кристаллического инсулина, Осаждение белковых примесей про-: водят после первого высаливания .хлористым натрием из раствора инсулинасырца при ,8-3,2 и температуре 3-5С, аморфный инсулин осаждают при концентрации ацетата цинка 0,35-0,5М на грамм инсулина при-рН 5,2-5,4, Источники информации, принятые вс внимание при экспертизе; 1. Авторское свидетельство СССР № 332832, кл. А 61 К 17/00, 1972.