Способ получения пептидов Советский патент 1979 года по МПК C07K7/06 A61K38/08 C07K1/04 A61K38/06 

Изобретение относится к способу по лучения новых пептидов, обладгоощих биологической активностью, которые мо гут найти применение в медицине для диагностики и терапии. В пептидной химии для синтеза пеп тидной цепи широко используют твердо фазный метод 1, Для удаления боковых защитных групп и отщепления поли мерной основы широко применяют фтористый водород с анизолом 2. Цель изобретения - синтез новых пептидов, обладающих ценными фармако логическими свойствами. Поставленная цель достигается пре лагаемым способом получения пептидов оацей формулы Г руго G u-His-Trp-X-Tyr-y-Leu-ArgPro-Zгде X - Ser; У - D-Trp,. D-Phe; Z - GtyNH, заключающимся в том, что соединение формулы Я R Г(pyro)Geu-His(N -R)-Trp-X(R Tyr(R) -Y-Leu-Arg ()-pro-Z , где значения X и Y указаны выше; Z -GeyA, где A- (полимерная асноВа) , лредспуаёдякшдй собой ЪензгидрилапияоЬую сналу; R - тозил; R - 2-бромбензилоксикарбонил; R - бензил; R - водород, обрабатывают реагентом, позволяющим отщепить все группы и полимерную основу. Предпочтительным вариантом способа является использование для удаления защитных групп и полимерной основы фтористого водорода. Процесс ведут при в течение 30 мин. Пример 1. Синтез L-пнроглутамил-Ь-гистидил(тозил)-L-триптофил-L-серил(бензил)-L-тирозил (2-бромбензилоксикарбонил) -D-триптофлл-лейцил-1,-аргйнил (тозил) -L-пропилглицилбензгидриламиновой смолы (pyro)G uHiS (N -R ) -Trp-Ser (R) -TyriR2 ) -Drp-Leu-Arg()-Pro-G yA, , где R-TOS; R -2-Br-c6ZE ; R-Bzt}. R -H; A - бензгидриламиновая смола (нерастворимая полимерная подложка, 36 содержасчая в своем составе группировки типа бенэгидриламина). 1,25 (1,0 ммоль) бензгидриламиново смолы помещают в реакционный сосуд автоматического пептидного синтезато ра фирмы Бекман (Модель 990), за программированного на проведение еле дующего цикла промывок; с) метиленхлоридом; б) 33%-ным раствором трифто зуксусной кислоты в метиленхлориде (2 раза в течение 2,5 и 25 мин); в) метиленхлоридом; г) этаиолом; д) хлороформом; е) 10%-ным раствором триэтилаг ина в хлороформе (2 ч по 25 мин); ж) хлороформом; з) метиленхлоридом, Промытую смолу перемешивают с 0,525 г (3,0 ммоль) трет-бутилоксикарбонилглицина в метиленхлориде в присутствии 3,0 ммоль дициклогексилкарбодиимида. Реакционную смесь пере мешивают при комнатной температуре (22-25С)2ч,после, чего аминокислотную смолу (т.е. полимерную, подложку с присоединенным к ней остатком трет-бутилоксикарбонилглицина) промывают последовательно метиленхлоридом (3 р за.) , этанолом (3 раза) и метиленхлоридом (3 раза). Далее присоединенную аминокислоту деблокируют 33%-ным рас вором трифторуксусной кислоты в метиленхлориде (двукратная обработка продолжительностью 2,5 и 25 мин каждый раз) и Промывают в соответствии с заданной программой, т.е. осуществляют весь цикл промывки, описанный вьаше, от стадии в) до стадии з) . Затем в реактор вводят следующую по счету (с С-конца синтезируемого пептида) N-защищенную аминокислоту (3,0 ммоль) и всю последовательность операций повторяют, как описано выше Осуществляют наращивание пептидной цепи следующими аминокислотами (каждую из которых вводят в реактор в ко личестве 3,0 ммоль), повторяя аналогичный цикл промывок и обработок:. t-Boc-L-пролив; t-Boc-L-аргинин-(Tos t-Boc-L-лейцин; t-Boc-D-триптофан; t Boc-L-тиpoзин (2-бромбензилоксикар бонил); t-Boc-L-серин(ВгП; t-Boc-L-Триптофан; t-Boc-L-гистидин (Tos); L-пйроглутаминовая кислота. После зайершения синтеза декапептидную смолу промывают метиленхлоридом (3 раза), затем, метанолом (3 раза) и сушат в вакууме до постоянного веса. В итоге получают привес,, равны 98% от ожидаемого теоретического при веса смолы, Бензгидриламиновая смола, использ ванная в этом примере, приобретена у фирмы Бэхем Инкорпорейтед в Мари ча дель Рей, Калифорния и получена с использованием 1% сшивающего агента Пример 2. Синтез L-пироглутамил-Ь-гистидил-Ь-триптофил-Ь-серил-тирозил-О-триптофил-Ь-лейцил-Ь-аргинил-Ь-пролил-глицивамида, т.е. пептида формулы Т , где X - Ser; Y -О-Тгр; Z - сеу-ЫНг; (руго)GEu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Trp-LeuArg-GEyNHj. Удаление защитных групп и отщепление синтезированного декапептида от декапептидной смолы, описанной в примере 1, проводят путем обработки 1 г последней 24 мл жидкого фтористого водорода и б мл анизола при при в течение 30 мин. Фтористый водород удаляют при пониженном давлении, а для удаления анизола остаток промывают этилацетатом. Сырой пептид чистят гель-фильтрацией на колонке (2,5 х 100 см) с сефадексом (марки Фаин), представляющим собой химически модифицированный, поперечносшитый декстран, причем элюцию осуществляют 2М раствором уксусной кислоты в воде. Фракции, которые по данным УФ-спектроскопии имеют основные пики поглощения в области 280 нм, объединяют и упаривают досуха. B.остатке получают вязкий Маслообразный продукт,. который вносят в колонку (2,5 X 100 см) с сефадексом Г-25, предварительно уравновешенным сначала с нижней фазой, а затем с верхней фазой системы растворителей н-бутанол:уксусная кислота;вода (4;1:5), Элюция с помощью верхней фазы этой системы растворителей дает фракцию с одним основным пиком поглощения. Вещество, выделенное из этой фракции, подвергаю элюции на колонке (1,4 X 94 см) с карбоксиметилцеллюлозой. Соответствующие фракции (10501190 мл) подвергают лиофилизации до постоянного веса и в остатке получают целевой продукт в виде белого пушистого порошка, выход 80 мг. Удельное вращение {(А -58,8° ( 1 и. уксусная кислота) По данным тонкослойной хроматографии в четырех различных системах растворителей при нагрузке на пластинку 20-30 мкг вещества и проявлении парами йода с последующей обработкой пластинки реактивом Эрлиха-(пятна наблюдали визуально), продукт показал себя однородным веществом. Ниже приводятся величины Rf, полученное при хроматографии в различных системах: 1-бутанол:уксусная кислота:вода (4:1:5; верхняя фаза) ,25; этилацетат: пиридин: уксусная кислота: вода (5:5:1:3) RfaO,63; 2-пропанол; ;1 М уксусная кислота (2:1) ,38; 1-бутанол;уксусная кислота:вода: Гэтилацетат (1:1:1:1) ,51. Аминокислотный анализ продукта дал слелуюадие результаты: -1,08; His0,95; .Тгр-2,00; Ser-0,94; Туг-0,97; Leu-0,93; ,9B; Pro-1,00; &Еу-1,02; NHa-1,03. Пример 3, Синтез L-пироглутамил- L-гистидил(тоэил)-L-триптофил-Ь-серил( бензил)-ь-тирозил (2-бромбензилоксикарбонил)-D-фенилаланил-Ь-лейцил-Ь-аргинил(тозил)-L-пропилглицилбензгидриламиновой смолы: R- (руго) Gtu-His (N -R ) -Trp-Ser (R ) Tyr(R.)-D-Phe-Leu-Arg(N -RM-ProGEy A, где R-Tos; R -2-BrCbz; R -Bzf; A - нерастворимая полимерная подложка бензгидриламинного типа. 1,25 г (1,0 ммоль)бензгидриламино вой смолы помещают в реакционный сосуд Бекмановского автоматического си тезатора пептидов (модель 990), запро граммированного на проведение следую щего промывного цикла: а) метиленхло ридом; б) 33%-ным раствором трифторуксусной кислоты в метиленхлориде (2 раза в течение 2,5 и 25 мин; в) метиленхлоридом; г) этанолом; д) хлороформом; е) 10%-ным раствором триэтиламина в хлороформе (2 раза по 25 мин ж) хлороформом; з) метиленхлоридом. После такой промывки смолу переме шивают с 0,525 г (3,0 ммоль) трет-бутилоксикарбонилглицина в метиленглориде, куда прибавляют 3,0 ммоль дицик логексилкарбодиимида. Реакционную смесь перемешивают при комнатной температуре (22-25°С) 2 ч, после чего полученную аминокислотную смолу промывают последовательно метиленхлоридом (3 раза), этанолом (3 раза) и метиленхлоридом (3 раза). Аминокислоту присоединенную к полимерной подложке деблокируют обработкой 33%-ным раствором трифторуксусной кислоты в метиленхлориде (2 раза в течение 2,5 и 25 мин), после чего смолу промывают в соответствии с заданной программой т.е. осуществляют весь цикл промывки описанный выше, от стадии в) до з). Далее проводят наращивание пептидной цепи ступенчатым методом - посредством последовательной конденсации следующих N-защищенных аминокислот, повторяя каждый раз весь цикл промывок и обработок: t-Boc-L-пролин; t-Boc-L-аргинин(Тоз); t-Boc-L-лейцин; t-Boc-D-фенилаланин; t-Boc-L-тирозин (2-Br-Cbz); t-Boc-L-cepHH(Bzt);t-Boc-L-триптофан; t-Boc-L-гистидин(Tos); L-пироглутаминовая кислота. После завершения синтеза полученную декапептидную смолу промывают метиленхлоридом (3 раза), затем метанолом (3 раза) и сушат в вакууме до постоянного веса, В итоге получают 100%-ный от теоретического привес смолы. Бензгидриламиновая смола,- использо ванная в этом примере, аналогична смо ле примера 1, Пример 4. Получение L-пироглутамил-Ь-гистидил-Ь-триптофил-Ь-серил-Ь-тирозил-О-фенил аЛанил-Ьг-л ейцил-Ь-аргинил-Ь--пропил-глицинамида, т.е, пептида формулы I. в которой X - Ser; У -D-Phe; ZGSyNHj; (pyro)Geu-HiS-Trp-Ser-Tyr-D-Phe-LeuArg-Pro-GtyNHj. Удгшение защитных Трупп и отщепление синтезированного декапептида от смолы, описанной в примерз 3, осуществляют посредством обработки 1,5г материала 24 мл фтористого водорода и 6 г«ш анизола при 0°С в течение 30 мин.. Фтористый водород удаляют при пониженном давлении, а анизол - промывкой остатка этилацетатом. Сырой пептид чистят гель-фильтрацией на колонке (2,5 х ЮО см) с сефадексом Г-25, представляющим собой химически модифицированный сшитый декстран, причем элюцию вещества осуществляют 2М водным раствором уксусной кислоты. Фракции, которые по данным УФ-спектроскопии дают основной пик поглощения в области 280 нм, объединяют и упаривают досуха в вакууме. Полученный в результате маслообразный прорукт наносят на колонку (2,5 X 100 см) с сефадексом Г-25, предварительно уравновешенным сначала с нижней фазой, а затем с верхней фазой системы растворителей н-бутанолгуксусная кислота:вода (4:1:5). . Элюция с помощью верхней фазы этой системы растворителей дает фракции, которые выходят из колонки одним основным пиком (по содержанию желаемого вещества), Эти фракции объединяют и упаривают досуха при пониженном дав- лении. Остаток лиофилизуют из 0,2 и, уксусной кислоты, в результате чего получают целевой продукт в виде белого пушистого порошка. Выход продукта 158 мг; удельное вращение оС -57,5 (,55; 0,1 н, уксусная кислота). Судя по результатам тонкослойной хроматографии в четырех различных системах растворителей (при нагрузке на пластинку 20-30 мкг вещества и проявлении пятен путем выдерживания пластинок в парах йода с последующей обработкой реактивом Эрлиха), полученный продукт представляет собой соввЕшенно однородное вещество. Величины IRf , полученные при истользовании различных систем растворителей для ТСХ, приведены ниже: 1-бутанол:уксусная кисло-та:вода (4:1:5, верхняя фаза) ,l4; этилацетат:пиридин:уксусная кислота: вода (5:5:1:3) ,68; 2-пропанол: 1 М уксусная кислота (2:1) ,41; 1-бутанол:, уксусная кислота:вода:этилацетат (1:1:1:1) Rf-0,47. Аминокислотный анализ полученного продукта дал следующие результаты: GEu-1,01; His-0,97; Trp-0,90; Ser-0,92;Tyr-l,ОС; Phe-0,96;Leu-l,00 Arg-1,02; Pro-0,95; ,OD; NH3-1,00, Формула изобретения 1, Способ получения пептидов общей формулы I pyro ceu-His-Trp-X-Tyr-Y-Leu-Argгде X - Ser; Y - D-Trp,. Z - GE uNHz, отличающийся тем, соелинение формулы II (pyro)GEu-His (N -R )-Trp-X(R Tyr(R)-Y-Leu-Arg(N-R )-Pto-z2 где X и У имеют указанные значени А, где А у-CR-fh-(полимерная осноВа) , лредстабляющая соВой 5екэгидриланииоЬую тозил; pZ 2-бромбензилоксикарбонил; 8 R - бензил; R - водород, обрабатывают реагентом, позволяющим отщепить все защитные группы и полимерную основу, 2. Способ по п. 1, отличающ и и с я тем, что отщепление защитных групп и полимерной основы осуществляют фтористым водородом при в течение 30 мин. Источники информации, принятые во внимание при экспертизе 1. Стюарт Д. М,, Дженнис Д, Твердофазный синтез пептидов, М., Мир, f971, 2.V-i6bep5..e.T. Sadies on роЕуloeptides,/Part xi . conden&at-ton by cjizide ccupt-rng w-ith a роЕс/глег -bound |эсрtide. .Trav. СИегп.,1970, 89, 880,