Способ получения пептидов Советский патент 1990 года по МПК C07K14/61 A61K38/25 

Изобретение относится к способу получения пептидов - аналогов hp GRF человека, новых биологически активных соединений, которые могут найти применение в медицине.

Цель изобретения - способ получения новых пептидов-аналогов hp GRF человека, малотоксичных, обладающих б9лее высокой ростостимулирующей активностью.

Сокращения, используемые в описании:

DCC-N,N - дициклогексилкарбодиимид; HOBt - 1-гидроксибензтриазол; ONp - п-нитрофенил; Вое - третбутилоксикарбонил; Tos - 4-толуолсульфонил; 2C1-Z - 2-хлорбензилоксикарбонил;

DCB - 2,6-дихлорбензил; OBzl - сложный бензиловый эфир,

см

Пример 1. Синтез Nle2TJ--hp , GRF/1-32/-NH 9 имеющего формулу

11-Tyr-Ala-Asp-Ala-Tle-Phe-Thr-Asn- Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu- t Ser-Ala-ArR-Lysr-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile- Nle Ser-Ar.f5-Gln-Gln-Gly-NH2, осуществляют ступенчато, используя пептидный синтезатор Бекман-990, на смоле хлоргидрата МВНА, такой, например как jg зау, используют смесь 50% диметилфорМеОН0,5 ,

CHjCl (дважды) 0,5

Таким образом, от 1 до 2 ммоль Вос-защищенной аминокислоты в хлористом метилене используют на грамм смолы в сочетании с одним эквивалентом 1,0 М DCC1 в хлористом метилене в течение 2 ч. Когда Boc-Arg (TOS) свясмола, поставляемая фирмой Bachem, The, имеющая диапазон замещения от 0,1 до 0,5 ммоль/г смолы. Связывание Boc-Gly к смоле осуществляют способом, описанным в программах А и В, который используют в ходе всего синтеза, что приводит к замещению примерно 0,35 ммоль глицина на грамм смолы, Все используемые растворители тщательмамида и хлористого метилена. Бензило- вый эфир используют в качестве защитной гидроксильной группы боковой цепи для серина и треонина. Пара-нитро- фениловый сложный эфир (ONp) используют для активации карбоксильного конца аснатина или глицина, Например,, Boc-Asn.(ONp) связывают в течение ночи, используя один эквивалент HOBt

зау, используют смесь 50% диметилфорМеОН0,5 ,

CHjCl (дважды) 0,5

Таким образом, от 1 до 2 ммоль Вос-защищенной аминокислоты в хлористом метилене используют на грамм смолы в сочетании с одним эквивалентом 1,0 М DCC1 в хлористом метилене в течение 2 ч. Когда Boc-Arg (TOS) свямамида и хлористого метилена. Бензило- вый эфир используют в качестве защитной гидроксильной группы боковой цепи для серина и треонина. Пара-нитро- фениловый сложный эфир (ONp) используют для активации карбоксильного конца аснатина или глицина, Например,, Boc-Asn.(ONp) связывают в течение ночи, используя один эквивалент HOBt

ИЗОБРЕТЕНИЕ КАСАЕТСЯ ПЕПТИДОВ, В ЧАСТНОСТИ ПОЛУЧЕНИЯ СОЕДИНЕНИЙ ОБЩЕЙ Ф-ЛЫ HR₁-ALA-ASP-ALA-JLE-PHE-THR-ASN-SER-TYR-ARG-LYS-VAL-LEU-GLY-GLN-LEU-SER-ALA-ARG-LYS-LEU-GLN-ASP-JLE-R₂₇-SER-ARG-GLN-GLN-GLY-NH₂, ГДЕ R₁=TYR ИЛИ HIS+ R₂₇ - NLE, MET, ДЛЯ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ В МЕДИЦИНЕ КАК РОСТИМУЛИРУЮЩИЕ СРЕДСТВА. ЦЕЛЬ - СОЗДАНИЕ НОВЫХ БОЛЕЕ АКТИВНЫХ И МАЛОТОКСИЧНЫХ ВЕЩЕСТВ УКАЗАННОГО КЛАССА. СИНТЕЗ ПЕПТИДА ВЕДУТ СВЯЗЫВАНИЕМ C-КОНЕЧНОЙ АМИНОКИСЛОТЫ - ГЛИЦИНА С ЗАЩИЩЕННОЙ NH₂-ГРУППОЙ С ПОЛИМЕРОМ-НОСИТЕЛЕМ - СМОЛОЙ МВНА В СООТНОШЕНИИ 2 ММОЛЬ АМИНОКИСЛОТЫ НА 1Г СМОЛЫ В СРЕДЕ МЕТИЛЕНХЛОРИДА ИЛИ ДИМЕТИЛФОРМАМИДА, ИЛИ ИХ СМЕСИ. ЗАТЕМ ПРОВОДЯТ ПОСТЕПЕННОЕ НАРАЩИВАНИЕ ПЕПТИДНОЙ ЦЕПИ В СООТВЕТСТВИИ С ЦЕЛЕВЫМ ПЕПТИДОМ ДО ОБРАЗОВАНИЯ ПЕПТИДИЛПОЛИМЕРА Ф-ЛЫ X-R₁(X₁ ИЛИ X₄)-ALA-JLE-PHE-THR(X₃)-ASN(X₅)-SER(X₃)-TYR(X₄)-ARG(X₁)-LYS(X₁)-VAL-LEU-GLY-GLN(X₅)-LEU-SER(X₃)-ALA-ARG(X₁)-LYS(X₆)-LEU-LEU-GLN(X₅)-ASP(X₂)-JLE-R₂₇-SER(X₃)-ARG(X₁)-GLN(X*05)-GLN(X₅)-GLY-X₇, ГДЕ R₁ И R₂₇ УКАЗАНЫ ВЫШЕ

X-ВОС

X₁-ТОЗИЛ

X₂-OBZL

X₃-БЕНЗИЛ

X₄-ДИХЛОРБЕНЗИЛ

X÷КСАНТИЛ

X₆-2-ХЛОРБЕНЗИЛОКСИКАРБОНИЛ

X₇-СМОЛА-НОСИТЕЛЬ МВНА. ДАЛЕЕ ПРОВОДЯТ ДЕБЛОКИРОВАНИЕ ПЕПТИДИЛ ПОЛИМЕРА И ОТЩЕПЛЕНИЕ ПЕПТИДА С ПОМОЩЬЮ HF СОВМЕСТНО С АКЦЕПТОРОМ-АНИЗОЛОМ ИЛИ МЕТИЛЭТИЛСУЛЬФИДОМ, ИЛИ ИХ СМЕСЬЮ, ПРИ 0-(-20)°С С ПОСЛЕДУЮЩИМ РАСТВОРЕНИЕМ В УКСУСНОЙ КИСЛОТЕ И ОЧИСТКОЙ. 1 ТАБЛ.

но обезгажнвают путем продувки инерт- 20 в 50% смеси диметилформамида и хлорис30

ым газом, например гелием или азотом, тобы гарантировать отсутствие кислоода, который может окислить серу осатка метионина, что нежелательно.

После удаления защиты и нейтрали- 25 зации пептидную цепь ступенчато нара- ивают на смоле. Удаление защиты, нейтрализацию и добавление каждой аминокислоты осуществляют по сформулированным ниже программам.

Удаление защиты предпочтительнее осуществлять по программе А. Программа А

Реагент Время смешиванияэ

мин

60% трифторуксус- ная кислота/2% этандитиол 60% трифторуксус- ная. кислота/2% этандитиол 1РА/1% этандитиол EtjN (10%) в СН2С12 Me ОН

Et9N (10%) в МеОН (дважды) СН2С17 (дважды)

Связывание предпочтительнее осуществлять по программе В Программа В

10

15 0,5 0,5 0,5

0,5 0,5 0,5

35

40

50

Время смешивания, мин

50-90 0,5 0,5

15,0 0,5

0

5

5

0

0

5

того метилена, причем в этом случае DCC не добавляют. Аминогруппу аснатина и глутамина защищают ксантилом, если DCC-связывание применяют вместо использования активного эфира, 2-хлор- бензилоксикарбонил (2С -Z) используют в качестве защитной группы для боковой цепи лизина. Для защиты гуанидино- группы аргинина используют тозил5 а карбоксильную группу глицина или аспа- рагина защищают сложным бензиловым эфиром (OBzl)„ йенольную гидроксиль- ную группу тирозина защищают с помо щью 2,6-дихлорбензила (DCB) . В конце синтеза получают следующую композицию;

Х-Туг(X -Ala-Asp(X t)-Ala-Ile-Phe- -Thr(X3)-Asn(Xff)-Ser((X4)- -Агя(X 1 g)-Lys (X,) -Val Leu-Gly-Gln(X )- -Leu-Se r(X3)-Ala-Arg(X ,)-Lys(X/)- ,.., -Leu-Leu-Gln(Xj-)-Asp(X) -Ile-Nle- -Ser(X3)-Arg(X)-Gln(Xs)-Gln(Xs.)- -Gly-X.p где X представляет собой Вос X 1 - тозил, Х4 - сложный бензиловый эфир (OBzl) s Х3 - бензил Х - дихлор- бензил5 X g - ксантилэ Хй - 2-хлорбенз- илоксикарбонил и X 7 - -NH-поддожка смолы Ксантил может быть частично или полностью удален при обработке трифторуксусной кислотойs используемой для удаления of-аминбзащитной группы о

После связывания остатка тирозина со смолой Вое удаляют с помощью 60%-ной трифторуксусной кислоты в СН2С1 г. Для расщепления и удаления защиты с оставшегося защищенного пептида-смолы его обрабатывают 15 5 мл анизола, 0,5 мл метилэтилсульфида и 15 мл фтористого водорода .(HF) на

грамм пептида-смолы при -20е С в течение 1 - 0,5 ч и при 0°С в течение 1 - 0,5 ч. После удаления HF под высоким вакуумом остаток смолы-пептида промывают поочередно безводным диэти- ловым эфиром и хлороформом, а затем пептид экстрагируют обезгаженным 2 н. раствором уксусной кислоты и выделяют из смеси фильтрованием.

Отщепленный и лишенный защиты пептид растворяют в 0,5%-ной уксусной кислоте и подвергают очистке, которая может включать тонкую гель-фильтрацию на Сефадексе DG-50.

Затем пептид подвергают дальнейшей очистке с помощью препаративной или полупрепаративной высокоэффективной жидкостной хроматографии. Гильзы для Le-500 фирмы Waters associates заполняют кремнеземом 15-20 мк, поставляемым фирмой Vydac (300A). Градиент ацетонитрила создают с помощью аппарата для получения градиента низкого давления фирмы Eldex. Хро- матографические фракции тщательно контролируют с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии и объединяют только фракции, проявляющие существенную частоту. Обессоливание очищенных фракций, проверенных на чистоту независимо, осуществляют, используя ацетонитрил в 0,1%-ной трифтор- уксусной кислоте. Окончательное элюи- рование осуществляют из аналитической колонки Vydal Cf (5 мк), используя смесь буферов А и В. Буфер А представляет собой 0,1%-ную водную трифтор- уксусную кислоту, буфер В содержит 60 об.% ацетонитрила, 0,1% трифтор- уксусной кислоты, остальное - E-iQ. Для изократической смеси, содержащей 58 об,% буфера В, пептид элюируют при 9,2 мл. Центральный срез лиофилизи- руют, чтобы получить нужный пептид, чистота которого составляет свыше 98%.

Оптическое вращение измеряют на фотоэлектрическом поляриметре, как величину С°П -57,8°±1 (,1%-ная уксусная кислота, нескорректировано).

Пример 2. Синтез hp GRF аналога D-Tyri }-hp GRF(1-32)-NH2, имеющего формулу H-D-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile- -Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu- -Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu- -Leu-Gln-Asp-Ile-Met-Ser-Arg-Gln- -Gln-Gly-NH , проводят ступенчато, используя пептидный синтезатор Бек

o

5

0

5

0

ман-990, на смоле МВНА по способу, , описанному в примере 1. Определяют чистоту пептида с помощью тонкослойной хроматографии и высокоэффективной жидкостной хроматографии при элю- ировании из колонки при 8,6 мл с использованием 60 об.% буфера В. Оптическое вращение измеряют на фотоэлектрическом поляриметре, как величину оП ,4°i1 (,1%-ная уксусная кислота, нескорректировано). П р и м е р 3. Синтез CD-Met 27J- -hp GRF(1-32)-NH, имеющего формулу H-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn- -Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu- -Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile- -H-MeL-Ser-Arg-Gln-Gln-Gly-NH, осуществляют ступенчато, используя пептидный синтезатор Бекман-990, на смоле МВНА по способу, описанному в примере 1. Определяют чистоту пептида с помощью тонкослойной хроматографии и высокоэффективной жидкостной хроматографии при элюировании из колонки при 7,6 мл с использованием 57% буфера В. Оптическое вращение измеряют па фотоэлектрическом поляриметре, как величину fo -54,5°± -1 (,1%-пая уксусная кислота, нескорректировано) .

П р и м е р 4. Синтез Gys1J-hp GRF(1-32)-NHi, имеющего формулу H-His- -Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr- r -Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala- -Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-Ser- -Arg-Gln-Gln-Gly-NH-i, осуществляют ступенчато, используя пептидный синтезатор Бекман-990, на смоле МВНА по способу, описанному в примере 1. Определяют чистоту пептида с помощью тонкослойной хроматографии и высокоэффективной жидкостной хроматографии, при элюировании из колонки при 9,0 мл с использованием 54% буфера В. Оптическое вращение измеряют на фотоэлектрическом поляриметре, как величину Ul LQ -58,70i1 (,1%-ная уксусная кислота, нескорректировано).

Синтез повторяют, используя His в качестве последнего остатка, чтобы получить (HisVhp GRF( 1-32)-NH2. Определяют чистоту пептида при элюиро- вании из колонки при 9,2 мл с использованием 58% буфера В. Оптическое вра- измеряют на фотоэлектрическом поляриметре, как величину -58, (,1%-ная уксусная кислота, нескорректировано).

0

5

0

5

ПримерЗ. Синтез Gvs1, NleiTj- -hp GRF(1-32)-NHj, имеющего формулу , H-His-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr -Asn- -Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu- 5 -Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile- Nle-Ser-Arg-Gln-Gln-Gly-NH2, осуществляют ступенчато, используя пептидный синтезатор Бекман-990, на смоле МВНА по способу, описанному в приме- Ю ре 1. Определяют чистоту пептида с по- мо;щью тонкослойной хроматографии и высокоэффективной жидкостной хроматографии, при элюировании из колонки при

9,6 мл с использованием 57% буфера В. 15 после инъекции. Содержание гормона

Оптическое вращение измеряют на фотоэлектрическом поляриметре, как величину -59, (,1%-ная уксусная кислота, нескорректировано).

Синтетические пептиды, полученные в различных примерах, сравнивают с очищенным синтетическим hp GRF(1-40)- -ОН либо с очищенным синтетическим hp GRF (1-40) -Фен-Гли-Ш2 в анализах in vitro, чтобы определить их эффективность как стимуляторов выделения гормона роста. Все эти синтетические аналоги обладают существенной действенностью в стимулировании выделения гормона- роста.

Анализы in vitro выполняют с использованием синтетического hp GRF в качестве стандарта при параллельном сравнении с эквимолярными концентрациями различных синтезированных аналогов. Используют культуры, содержащие клетки питуитарных желез крысы, удаленные за четыре-пять дней до этого. Культуры, которые считаются опти- мальными для выделения гормона роста, используют для сравнительного испытания по общему способу. Инкубирование с испытуемым веществом осуществляют в течение 3 - 4 ч, Аликвоты культу- ральной среды удаляют и обрабатывают для измерения содержания в них имму- нореакционного гормона роста (ir GH) известным способом радиоиммуноанализа

Результаты сравнительного испытания с использованием эквимолярных кон центраций приведены в таблице.

Испытание in vitro синтетических пептидов показывает, что эффективная концентрация ЕС изменяется от 20 до 100 пМ. Самая низкая эффективная концентрация составляет 3-8 пМ. Максимальная эффективная концентрация дня hp GRF(1-40)NH.j составляла 1 нМ

Кроме испытаний in vitro проведены эксперименты in vivo путем введения синтетического пептида через постоянный катетер свободно передвигающимся самцам нормальных мышей. Животных предварительно обрабатывают FLA-63 допамингидроксилазным ингибитором, который подавляет спонтанное выделение, гормона роста,; не влияя на реакцию к экзогенному гормональному выделительному фактору (GRF). Образцы крови берут через тот же самый катетер перед введением, через 5 и 20 мин

0

5

5

0

Q

5

0

5

роста в крови измеряют путем радиоиммуноанализа.

Результаты показывают, что синтетические аналоги являются сильными стимуляторами выделения питуитарного гормона роста.

В испытаниях in vitro соединение GRF 1 2 несколько слабее, чем соответствующий природный гормон, В испытаниях Ln vivo оно проявляет биологическое действие по высвобождению гормона роста, которое существенно выше действия соответствующего гормона с незамещенным 32 остатком, а также выше стандарта.

Проведенные испытания показали, что соединения по изобретению малотоксичны и проявляют высокую ростостиму™ лирующую активность.

Формула изобретения

Способ получения пептидов общей формулы

HR1-Ala--Asp Ala Ile-Phe-Thr-Astt- -Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-, -Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile- R in-Ser-Arg-Gln-Gln-Gly-NHis где R - Туг, D-Tyr или Hisj

R 17 - Nle, Met,

отличающийся тем, что С-конечную аминокислоту - глицин с защищенной аминогруппой связывают с полимером-носителем - смолой МВНА в соотношении 2 ммоль аминокислоты на 1 г смолы, в метиленхлориде, или циметил- формамиде, или в их смеси и проводят постепенное наращивание пептидной цепи в соответствии с целевым пептидом до образования пептидилполимера общей формулы

X-R,(X 1 или Х4) -Ala-Asp(Xj-Ala- -Ile-Phe-Thr (X3) -Asn(X f) -Ser (X 3) -Tyr (X4)Arg(X ,)-Lys(X -Val-Leu-Gly-Gln(X)(X3)-Ala-Arg(Xp- -Lys (X«) -Leu-Leu-Gin (Xj) -Asp (X2) -Ile- -Rz7-Ser(X3)-Arg(X)-Gln((X5.)- -Gly(Xp,

где R1 и К17имеют указанные значения X - Вое;

X. т тозил;

Xj.- OBzl;

Х3 - бензил;

Х - дихлорбензил;

биологическая активность описываемых пептидов

Пептид

tNle77 -hp GRF(1-32)-NH7 Hislj-hp GRF(1-32)-NHt D-Tyr -hp GRA(t-32)-NH2 His I, Nle27J-hp GRF(t-32)-NH4

Примечание: Относительно hp GRF(1-40)

Xj- - ксантил;

Х6 - 2-хлорбензилоксикарбонил;

Х7 - смола-носитель МВНА, и полученный пептидил-полимер деблокируют и отщепляют пептид с помощью -HF вместе с акцептором, таким, как анизол, метилэтилсульфид или их смесь при температуре 0-(-20)° С с последующим растворением в уксусной кислоте и очисткой.

Относительная действенность in vitro

3,21(2,02-5,43) 2,15(1,12-4,41) 0,74(0,47-1,14) 3,22(2,12-5,33)

-Phe-Gln-NH

г