(54) ШТАММ LACTOBACILLUS ACIDOPHILUS 17 - ПРОДУЦЕНТ БАКТЕРИОЦИНА А 17 Изобретение относится к микробиологии и касается получения нового штамма - продуцента антибиотика бактериоцина, который может быть использован для бактериоцинотипирования и бактериоциногенотипирования лактобацилл, а также в ис, следованиях для излучения генетических элементов, детерминирующих синтез бактериоцина, их функциональных особенностей, химического состава, ,механизма действия. Известен штамм L. piaretarum 109-продуцент бактериоцина 1. Однако спектр действия этих бактериоцинов ограничивается подавлением роста ряда культур L. acidophilus, L. salivarins, L. jugurti, L helveticus, Llactis, L.delerueckii, L.fermenti и L.Buchneri. Целью изобретения является новый штамм LactoBacillus acidophilus 17, продуцирующий бактериоцин активный и против других видов лактобацилл. Предложенный штамм выделен из слюны человека. Штамп LactoBacillus acidophilus 17-продуцент бактериоцина А 17 депонирован в Музее культур промышленных микроорганизмов института «ВНИИ генетика под номером ЦМПМ В-1826. Морфологические признаки. На среде МРС-1 (48-часовая культура): умеренно полиморфные палочки 3-5 X 0,6-0,8 мкм, располагающиеся поодиночке, с закругленными концами. Волютиновых зерен не образуют, грамположительны. Спор и капсул не имеют. Неподвижны. Культуральиые признаки. Ацетатный агар. Через 72 ч роста при 37° в атмосфере углекислого газа образует до 2 мм в диаметре круглые, серовато-беловатого цвета колонии с выпуклой, гладкой, блестящей поверхностью, полупрозрачные, с волнистым краем, зернистой структурой, мягкой консистенции. Среда МРС-1. Через 24 ч при 37 равномерное помутнение и небольшой аморфный осадок. Состав среды МРС-. 1. Дистиллированная вода 200 мл, MnSOi,-4HiO 50 мг, цистеин 200 мг, Мд SOi,- 7Н,О 200 мг, KHiPO, 2 г, цитрат аммония 2 г, ацетат иатрия 5 г, глюкоза 20 г. 2. Дистиллированная вода 100 мл, пептон 10 г, твин 80 1 мл, дрожженой автолизат 50 мл, печеночный экстракт 100 мл. 3. Гидролизованиое молоко до I л; рН 6,2-6.6 1,5% агаровая скошенная среда МРС-1. Через 48 ч роста при 37° налет сероватобеловатого цвета с гладкой блестящей поверхностью, г(олупрозрачный, мягкой консистенции, располагающийся на поверхности среды. Среда МРС-5 (среда МРС-1 без цитрата аммония и ацетата натрия). Через 24 ч при 37° равномерное помутнение и небольшой аморфный осадок. Среда МРС-2 (среда МРС-1 с 0,150/0 агара). Не растет при 50 и 15°. Среда МРС-2 с 0,4% типоля. Рост отсутствует. Обезжире И)ое молоко с 5% дрожжевого автолизата и 1% глюкозы. Створаживание на 2 ; сутки. Среда Дейвиса (глюкоза 10 г, дрожжевой автолизат 50 мл, мел 100 г, хлорфениловый красный 40 мг, обезжиренное молоко до 1 л). Створаживание и пожелтение среды на 2 3 сутки. Молоко. Створаживание на 3 сутки. Физиологические и биохимические признаки. Факультативный анаэроб. Оптимальный РОСТ при 32-37°. Желатину не разжижает. Нитраты в нитриты не восстанавливает. Каталазу не образует. Среда Гибсона и Абд-эль-Малека. Ферментирует глюкозу без образования газа. Ферментирует целлобиозу, галактозу, мальтозу, сахарозу, маинозу, лактозу и салицин с образованием кислоты. Не рас(цепляет рамнозу, крахмал, сорбит и маннит. Молоко. Через 14 сут. содержание кислот достигает 0,65%. Антагонистические свойства. Образует бактериоцин А 17 на 1,5% агаровой среде МРС-1 и жидкой среде МРС-1. Получение бактериоцина на 1,5% агаровой среде МРС-1. Суточную культуру L.acidophilus 17 засевают уколом на чашку с 1,5% агаровой средой МРС-1 и выращивают 3 сут при 37° в вакуум-эксикаторах, в которых воздух заменен углекислым газом. Выращенную макроколонию стерилизуют парами хлороформа, после чего поверхность среды заливают вторым слоем (4 мл) 0,8% агаровой среды МРС-1, расплавленной и охлажденной до 46, смешанной с 0,5 мл 4 часовой индикаторной культуры Ljugurti NC3B 2889. После застывания среды посевы выращивают при 37° в течение 2 сут. Вокруг макроколонии L.acidophilus 17 наблюдается прозрачная с нечеткя.м краем зона подавления роста индикаторного штамма (18 мм в диаметре). Получение бактериоцина А 17 на жидкой среде МРС-1. Культуру L.acidophilus 17 засевают на жидкую среду МРС-1 и выращивают при 37° за 4 сут. Для стерилизации к культуре добавляют 10% хлороформа, перемешивают и выдерживают при 37° в течение 30 мин, после чего жидкость отделяют от хлороформа и центрифигуруют. Из насадочной жидкости готовят двукратные серийные разведения. По одной петле каждого разведения наносят на поверхность чашки с 1,5% агаровой средой МРС-1, засеянной 4-часовой индикаторной культурой L.jugurti NC3B 2889. После выращивания при 37° в течение 2 сут производят учет. Титр бактериоцина А 17 на жидкой среде МРС-1 1:16. Спектр действия бактериоцина А 17. Подавляет рост ряда культур L.acidophilus, L.saiivarius, L.helveticul L.jugurti, L.lactis, L.deleruecKii, L.fermenti. L.BUchneri, L.leichmannii и L.celloBiosus. He ингибируют рост культур L.casei, L.plantarum, L.Brevis и L.Viridescens. Бактериоцин A 17 инактивируется трипсином и химатрипсином, но резистентен к действию папанна, ДНК-азы, РНК-азы, и лизоцима. При 60° разрушается в течение 30 мни. Бактериоцин А 17 не реплицируется на индикаторном, штамме L.jugurti NC3B 2889 и хорошо диффундирует в агар. Не диффундирует через целлофан. Предлагаемый штамм L.acidophilus 17 по сравнению с известными продуцирует бактериоцин , который активен против ряда других видов лактобацилл, что может быть использовано для бактериоцинотипирования не только культур L.acidophilus, L.salivarins, L.helveticus , L.jugurti, L.lactis, L.delBruecKii, L.fermenti и L.BUchneri, но и культур L.leichmannii и L.celloeiosus. По чувствительности к бактериоцину AI7 (бактериоцинотипирование) культуры Lacidophitus, L.saiivarius, L.helveticus, L.jugurti, L.lactis, L.deiBruecKii, L.fermenti и L.BUchneri, a также L.leichmannii и L,celloBiosus подразделяются на два бактериоцинотипа: чувствительный к бактериоцину А17 (1) и устойчивый к бактериоцину А17 (2). При бактериоцинотипировании 588 культур лактобацилл разньГх видов получены следующие данные: из 187 культур L.acidophilus 9 культур относились к (I) и 178 - к (2); из 65 кyльтyp°L.salivaгins 4 относились к (1) и 61 --ко (2); из 16 культур L.jugurti 6 относились к (I) и 10 - ко (2); из 4 культур L.helveticus 3 относились к (1) и I - к (2); из 84 культур L.fermenti 1 относилась к (I) и 83 - к (2); из 13 культур L.BUchneri 2 относились к (1) и 11 - к (2); из 2 культур L.leichmannii 1 относилась к (1) и 1 - ко (2); из 3 культур L.celloBiosus 2 относились к (1)
и I ко (2); 2 культуры L.lactis и I культура LdelemecKii относились к (I). 211 культур Lcasei, L.plantarum, L.Brevis и L.Videsceus были устойчивыми и к бактериоцину А17.
По способности продуцировать бактериоцин AI7 (бактериоциногенотипирование) культуры лактобацилл указанных выше видов подразделяются на два бактериоциногенотипа: продуцирующий бактериоцин AI7 и не продуцирующий бактериоцин А17.
Штамм L.acidophilus 17 может использоваться в исследованиях по генетике и физиологии бактериоциногении лактобацилл при изучении химического состава бактериоцина AI7, механизма действия на чувствительные бактерии.
Применение предлагаемого штамма дает возможность по генетическим меткам (чувствительность или устойчивость к бактериоцину А17, наличие или отсутствие способности продуцировать бактериоцин А17) проводить дальнейшее, более глубокое и детальное внутривидовое подразделение не
только культур L.acidophilus, Lsalivarius, L.helveticus , L.jugurti, L.lactis, L.deleweckii,L.fermenti и L.eachneri, но н культур L.leichmannli и L.cellobiosus, обладающих одинаковыми биохимическими и физиологическими свойствами, на бактериоцинотипы и бактериоциногенотипы (бактериоцинотипирование и бактерноцнногенотипирование).
Формула изобретения
Штамм Lactosacillus acidophilus 17 - продуцет бактериоцина А17 (депонирован в Музее культур промышленных микроорганизмов института «ВНИИ генетика под нохмером ЦМПМ В-1826).
Источники информации, принятые во внимание прн экспертизе 1. Авторское свидетельство СССР по заявке № 2685277/28-13, кл. С 12 D 9/22, 1978.
