Реактив для определения триглицеридов Советский патент 1978 года по МПК G01N31/14 

(54) РЕАКТИВ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ТРИГЛИЦЕРИДОВ

12 ОтЛ:Ичительны;М лриэнаком реактива является то, что он дополнительно содержит карбоксилзстеразу, додецил-сз-льфат натрия, фосфОренолкиназу -и- сульфат магаия при жазанном содержании компонентов реактива. Предлагаемый ,реакт пв дозволяет сократить время проведения анализа в два раза, т. е. до 30 мин, и -количество потребления энз, .в 50 раз. В качестве буфера предпочтительно использовать 0,03-0,3 М .раствор триэтаноламина при рН 6-9 или боратный буфер. Пример 1. Приготавливают реактив, устойчивый при хранении, со.стоящий из пяти KOMinoHeHTOiB, которые леред употреблением смешивают, его 1мож:но хранить в виде смеси в течение 1-2 дней. Компо ненты: 0,1 моль триэтаноламиЕного буфера с рН 7,6, содержащего 3 ммоль сульфата магния, 1,5 мг1мл коровьевОго сывороточного альбумина и 0,1 А1г1мл додецилсульфата натрия (1); раствор 6 ммоль «икотина мидадениндинуклеотида в вобстановленной форме (ПАДИ), 33 ммоль АТФ и И ммоль фосфоенолпировиноградной кислоты в дистиллированной воде (2); кристаллическая суспензия 2 мг1мл лактатдегидрогеназы и 1 мг1мл фосфоенодкиназы (3); .раствор 0,2 липазы из Rhyzopus arrihizus и 4,0 мг1мл карбоксилэстеразы (4); кристаллическая суспензия 2 мг/мл глнц,еринкиназы (5). При умножении величины количества компонентов s мг/мл на 0,1 получают количество компонентов в вес. %. Для компонентов, указанных в ммолях, учитывается еще молекулярный вес. 2,9 мл ко.мпонеита 1, 0,1 мл компонента 2 и 0,02 мл компонента 3 смешивают и устанавливают температуру смеси 25° С. Затем др:ибавляют 0,1 мл сыворотки, .содержащей подлежащий определению триглиперид, и инкубируют 5 мин |прн .заданной температуре. Затем прибавляют ОД мл компонента 4, смесь выдерж.ивают 15-20 мин при указанной температуре и затем замеряют величину ЭКСТИНКЦ.ИИ на индикаторной шкале фотометра (при 366 или 340 нм). Эту величину обоз.начают . Затем пр.ибавляют к пробе 0,02 мл компонента 5 и через 10 мин снова замеряют экстинкцию. Замеренную величину обозначает 2- Еще через 10 1шн снова замеряют экстинкцию и замеренную Вбличину обозначают Е,. Расчет: АЕ(Е,-Е2)-(Е2-Е,). Общее кол.ичество .глицерина из триглицерида в лгг/ШО . 89,1. Описанное определение повторяют деять .раз, лр.ичем прибавляемое количество ыворотки может (быть уменьшено на 0,01 мл. Пр.и построении графика полученные таким образом значения AjE по отношению к применяемому количеству сыворотки образуют .прямую. Из определенных величин вычисляют пропорциональность (г), .равную 0,9986, по сравнению с г (идеальный случай), .равной 1,000, что показывает очень высокую точность метода. Пример 2 (для предельно низких концентраций отдельных компонентов). Определяют коэффициет изменения (К). .., стандартное отклонение (С) Q, . .( /о j . среднее значение (X) .100 Проводят 10 .измерений в 1 день, точно тааоке проводят 10 измерений в течение 10 дней по одно,му измерению в день. .Приготавл.ивают устойчивый при хранении .реактив, состоящий из пяти компонентов, которые смещ.ивают перед употреблением, в виде омеси они могут храниться в течение 1-2 дней. Компоненты: 0,03 моль триэтанола.минного буфера, рН 7,6, содержащего 3 ммоль сульфата магния, 0,1 мг/мл коровьего сывороточного альбумина и 0,01 мг/мл додецилсульфата натрия (1); pacTBiOp 1 лгмоль НАДН, 10 ммоль АТФ и 2 ммоль фосфоенолпировиноградной кислоты ;в дистиллированной воде (2); кристаллическая суспензия 0,5 мг/мл лактатдегидрогеназы и 0,2 мг/мл фосфоенолкиназы (3); раствор 0,1 мг/мл лииазы на Rhyzopus arrihizus и 0,5 мг/мл карбоксилэстеразы (4); кристаллическая суспензия 0,05 мг1мл глицеринкиназы (5). 2,9 мл ко мпонеита 1,01 мл компонента 2 и 0,02 мл компонента 3 смешивают и устанавливают температуру смеси 25° С. Затем прибавляют 0,1 жл сыворотки, содержащей подлежащий определению триглицерид и 15 мин инкубируют при 37° С. Затем прибавляют 0,1 мл К1ом.ионента 4, смесь выдерживают 35 мин при указанной температуре и затем при 316 или 340 нм считывают величину экст.пнкции по инди1каторной шкале фотометра. Эту величину обознают ,. Затем пр.ибавляют к пробе 0,02 мл компонента 5 и через 20 мин снова считывают экстинкцию. Эту величину обозначают Е.