Способ определения активности гидролаз Советский патент 1981 года по МПК G01N31/14 C12N9/16 C12N9/24 C12Q1/42 

(54) СПОСОБ ОПРЕДЕ;1ЕНИЯ АКТИВНОСТИ ГИДГОЛАЗ

Изобретение отиосится к определению активности гидролизирующих ферментов (гидролаз), и может быть применено в биохимии и в медицине для определения активности этих ферментов. Известен спектрофотометрический или флуоросцентньш стособ определения активности гид ролизирующих ферментов, заключающийся в регистращш скорости образования хромофорных или флуорофорных продуктов 1. Однако зтот способ не применим для непрозрачных сред, кроме того, требует дорогостоящей аппаратуры. Наиболее близким к предлагаемому является способ определения активности гидролазы, в частности, щелочной фосфатазы, заключающийся во взаимодействии в буферном растворе фермента с субстратом, представляющим собой органический эфир фосфорной кислоты, и определешга количества высвобождающегося в ходе реакции свободного фосфата спектрофотомет {жческнм путем в присутствии специфических j)eareHTOB. По полученным спектрофотометрическим данным - величине оптической плотности - судят об активности фepмeнтaC J. Недостатком данного способа является невозможность определения активности в непрозрачных и окрашенных средах, а также то, что он включает дополнительную процедуру спектрофотометрнческого определения продукта реакции в присутствии дополнительных реагентов. Данный способ не поддается автоматизации. .Целью изобретения является упрощение процесса и обеспечение возможности определения активности в непрозрачных и окращенных средах. Поставленная цель достигается способом определешш активности гидролаз, заключаншдамся во взаимодействии фермента с субстратом, представляющим собой органический , образуюцщм в результате реакции пирокатехин ион или п-аминофенолят-ион, и определения количества последних в присутствии электрохимического преобразователя при потенциале анода 0,18-0,3 В путем измерения тока. По скорости нарастания тока судят об активности фермента. 38 Обычно в качестве гидролаз используют щелочную фосфатазу или (J-глюкозидазу, в первом спучае в качестве субстрата обычно используют моноортофосфат пирокатехина или моноортофосфат п-аминофенола 0,18-2 мм, а в качестве буферного раствора - 0,1-0,2 М трис-НС& буфер, содержащий 0,01-0,02 М MgS04; во вто ром случае в качестве субстрата обьгчно используют D-глюкозид п-аминофенола 6,18-3 мМ, а в качестве буферного раствора - 0,1-0,2 М ацетатный буфер. В качестве щелочной фосфатазы обьршо использУют также ферментативные системы интакт ных клеток Е со И (т.е. щелочную фосфатазу, содержащуюся непосредственно в упомянутых клетках), при этом в качестве субстрата исполь зуют моноортофосфат пирокатехина в количестве 0,18-3 мМ, а в качестве буферного раствора - 0,1 0,2 М трис-НС1 буфер, содержапщй 0,01-0,02 М MgSO4. Существенными отличиями способа являются: использование -в качестве субстрата эфира, образующего в результате реакции пирокатехин ион или п-аминофенолят-ион, определение количества последних в присутствии электрохимического преобразователя при потенциале анода 0,18-0,3 В путем измере1шя тока, а также то, что об активности фермента судят по скорости шрастания тока. На чертеже изображен электрохимический преобразователь. Для осуществления способа применяют элект рохимический преобразователь, состоящий из платанового анода, электрода сравнения и вспомогательного электрода (см.. чертеж). Потенциал анода подбирают в интервале 0,18-0,3 В, в зависимости от конкретной системы. Способ включает следующие операции: растворение субЬтрата в буферном растворе, погружение в упомянутый раствор электрохимического преобразователя, введение в раствор определяемой гидролазы, наложение напряжения, измерение тока. Пример. Для определения активности щелочной фосфатазы берут 0,1 М трис-НСЕ, 0,01 М MgS04 буфер, который содержит 2 мМ моноортофосфат пирокатехина или 1 мМ моноортофосфат п-аминофенола ,рН - 8,0,25°С. В раствор погружают электрохимический преобразователь и вводят пробу щелочной фосфатазы Если в качестве субстрата применяют моноортофосфат пирокатехина, потенциал анода yctaнавливают 0,3 В относительно Ag/AgCB электрода, если в качестве субстрата применяют моноортофосфат - п-аминофенола, потенциал анода устанавливают 0,18 В относительно Ag/AgCE электрода. Регистрируют увеличение тока во времени. Скорость увеличения тока прямо пропорциональна гидролазной активргости. Измерение занимает 1-3 мин (см. табл. 1 и 2). Измерение активности щелочной фосфатазы в присутствии в качестве субстрата моноортофосфата пирокатехина приведено в табл. 1. Измерение активности щелочной фосфатазы в присутствии в качестве субстрата моноортофосфата п-аминофенола приведено в табл. 2. . П р и М е р 2. Для определения активности |3-глюкозидазы берут 0,1 М ацетатный буфер, который содержит 1,5 мМ Д-О-глюкозид п-аминофенола рН - 4,7, температура 25° С. В раствор погружают электрохимический преобразователь и вводят пробу определяемой (3-гликозидазы. Потенциал анода устанавливают 0,3 В. относительно Ag/AgCE электрода. Регистрируют увеличение тока во времени. Скорость увеличения тока прямо пропорциональна гидролазной активности. Измерение занимает 1-3 мин. Измерение количества |3-глюкозидазы приведено в табл. 3. Регрессионный анализ результатов определе1шя показывает хорошие совпадения результатов предлагаемого способа с известными спектрофотометрическими способами, коэффициенты корреляции для примеров, приведенных в табл. 1, 2 и 3, равны соответственно 0,9998, 0,9989, 0,9999. П р и М е р 3. Для определения активности щелочной фосфатазы непосредственно в интактных клетках E.coEi берут 0,1 М трис-НСС 0,01 М IVlgS04 буфер, содержащий 2 мМ моноортофосфат пирокатехина, рН - 8,0, при 25° С. В раствор погружают электрохимический преобразователь и вводят пробу определяемой гидролазы. Потенциал анода устанавливают 0,3 В относительно Ag/AgCe электрода. . Регистрируют увеличение тока во времени. Скорость )шеличения тока прямо пропорциональна гидролазной активности. Измерение занимает 1-3 мин. Определение активности щелочной фосфатазы непосредственно в интактных клетках Ё. coBi приведено в табл. 4. Из табл. 4 видно, что .наблюдается строго дшнейная зависимость между количеством клеток и определяемой ферментативной активйостью. П р и М е р 4. Зависимость Скорости увеличения тока преобразователя от концентрации ферментов описывается Михаэлисовской зависимостью. Зависимость скорости увеличения тока от концентрации субстратов устанавливают при концентрации щелочной фосфатазы по обоим субстратам 0,026 ед/мл, рН 8,0, в 0,1 М трис-НСе, 0,01 М MgSO4,25°C. Потенциал анода для моноортофосфата п-аминофе юла 0,18 В относительно Ag/AgC электрода. Кащентрация /3-глюкозндазы по |3-0-глюкозиду п-аминофенола 0. , рН 4,7, в 0,1 М ацетатном бу58731256

фере, при 25° С. Потенциал анода 0,3 В относи-ти увеличения тока от концентрации субстрата

тельно Ag/AgCE электрода. Зависимость скорС-в присутствии гидролаз приведена в табл. 5.

Скорость изменения тока преобразователя, нА/мин

3,662,6

5,05,2

6,717,8

8,010,4

11,613,0

13,0 .15,6

12,6618,2

19,33 .,23,4

корбеть изменения тока IКоличество щелочной фосфахазы,

реобразователя, нА/мин I10 ед/мл

..

52,6

2,3 -7,8

20,7. 13,0

Скорость изменения токаКоличество |3-глюкозидазы,

преобразователя, нА/мин10 ед/мл

0,73

1,53

2,6

3,4

6,5

Т а б л и ц а 1

Количество щелочной фосфатазы,

0 ед/мл

Т а б л и ц а 2

ТаблицаЗ

3,7

7,4

14,5

22,3

37,0

Скорость измене1шя тока преобразователя, нА/мин

1,47

2,87

4,5

5,95

7,3

Формула изобретения

Количество клеток в см

4,6. 10

9,2- 10

13,810

18,410

2310

Таблица 5

3 мМ, а Е качестве буферного раствора ОД-0,2 М трис-НСВ-буфер, содержащий 0,010,02 М MgS04.V

Исгочники информации, принятые во внимание при экспертизе

1 Н И, Rufgrneys, Methods of Enayrnatic АлаПзЕ8 AsKiee-is Prsss, , London, 1965, 783.

57 (прототип).

BtecheiT:. leSP., ;