Способ получения д-фенилглицина и его производных Советский патент 1981 года по МПК C12P13/00 

1

Изобретение относится к технике ,получения 0-фенилглицина и его произiводных и может быть использовано в микробиологической и фармацевтической 5 промышленности.

Известен способ получения оптически активных аминокислот путем ферментативного гидролиза их производных, например фенилглицина или его произ- tO водного микроорганизма Agotobactes СИОднако известный способ сложен и не предусматривает высокого выхода целевого продукта с необходимой оптической чистотой.

Известен также способ получения 0фенилглицина и его производных путем ферментативного гидролиза рацематов 5-фенилгидантоина и его производных 2.

Однако процесс ферментативногогид-2о ролиза по этому способу сложен, так как он ведется в несколько стгщий.

Цель изобретения - упрощение процесса.

Поставленная цель достигается тем,25 что согласно предлагаемому способу получения 0-фенилглицина и его производных путем ферментативного гидролиза рацематов 5-фенилгидантоина и его производных, ферментативный гидролиз о

рацематов 5-фенилгидантоина и его производных осуществляют штаммом Agrobacterium sp. NRRL В 11291. Способ осуществляют следующим обра:3Ofj|.

Ферментативный гидролиз рацематов 5-фенилгилантоина и его производных осуществляют штаммом Адrobacteriurn sp. NRRL В 11291.

Штамм Agrobacteriurn sp.NRRL В 11291 имеет следугацие свойства.

Микроскопическая морфология обра- зована дискретными стержнями, иногда спаренными, грамм-отрицательный, 0,8х х1,5-2,0 мк, капсулы и споры отсутствуют, передвижение с помощью перитрихиальных жгутиков. Макроскопическая морфология образована колониями на агаровой питательной среде, выпуклые края равные, кремового цвета, прозрачные, диаметр 0,5-1 мм, поверхность гладкая, буйный рост на кальций глицерофосфат-маннит-агаре с побурением и образованием гало.

Биохимические свойства. Выращивание от 4°С до 39°С на всех простых лабораторных средах без ростовых факторов и аминокислот, используя NH, jNO или аминокислоты в качестве единственного источника азота, оксидаза - положительно, каталаза - положительно, нитриты получены из нитратов . Лакмусовое молоко - серо-коричневое. Усвоение карбогидратов - окисление. Штамм Адrobacteriurn sp. NRRL В 11291 выделен Северным региональным научно-исследовательским центром Пеории, шт. Иллинойс (CIiIAj . Микроорганизмы рода Адrobacteriurn выращивают в аэробных условиях в куль туральной среде, содержащей источни|Ки азота, углерода, фосфора и мине- , ральных солей при температуре от 20 до 40°С, предпочтительно от 26 до 35°С, в течение от 10 до 48 ч, предпочтительно от 20 до 30 ч, при рН 6,0-8,0, предпочтительно от 7 до 7,5 В качестве источников углерода ис пользуют глюкозу, лактат, ацетат, лактозу и жидкость для замачивания зерна. Источниками азота служат мясные гидролизаты, гидролиздты казеина и соевых бобов, соли аммония и мочевина, гидантоины и N-карбамоильные про изводные аминокислот. Культуральная среда содержит следующие ингредиенты, г: мясной пентон 5, мясной экстракт 5, глюкоза 5 и во да дистиллированная 1000 мл, рН равно 7,0-7,2. D-аминокислоты получают непосредственно в ферментативной среде, содержащей OL-гидантоин или ОL-N-кар бамоильные производные аминокислот как в виде единственных источников азота, так и совместно с обычными и точниками азота. О-аминокислоты получают также пу тем использования микробной суспенз в виде покоящихся клеток или ее экс рактов . Экстрагирование из бактериальной суспензии ферментативных комплексов осуществляют известным способом, принятым в ферментологии. Клетки ра рушают в соответствующем аппарате, например во французском прессе с да чиком давления, гомогенизаторе Монт на Галинга, вращательных дезинтегра TOpaXj а также с помощью ультразвуковых вибраторов. Гидролиз гидантои нов или Н-карбамоильнвх производны аминокислот осуществляют путем доба ления в реакционную- смесь фермента в следующих формах; свежие клетки; клетки, выпущенные при температуре ниже 0°С, модифицированные клетки ацетоновый порошок, либо .серые или очищенные экстракты. Пример. ГотовятбулЬон, содержащий следующие ингредиенты, г мясной пентон 5; мясной экстракт 3) глюкоза 5 и дистиллированная вода 1000 мл. G помощью соды рН среды оводят до 7,2, после чего кульуральную среду разделяют на порции о 100 мл и каждую помещают в колбу 500 мл емкостью.. Стерилизуют 30 мин при 110°С и в колбы заседают культуру штамма: № 1302 из бкошенного агара, содеращего ту же среду с добавлением 2%-ного агара (OJFCO) и выращивают 24 ч при с перемешиванием при скорости вращения мешалки 220 об/мин. Из этой предкультуры (Д.О. при 550 нм: 0,250ддХ1:10 высевают 1 мл в пять колб по 500 мл, содержащих 100 мл той же среды, после чего культуру выращивают при 30°С и перемешивании при 220 .об/мин в течение 24 ч (Д.О. при 550 нм - 0,.250 дл 1:10. Затем эти клетки собирают, промы вают в физиологическом растворе и суспендируют в 100 мл пирофосфатного буферного раствора (0,1 м рН 1,1) , содержащего 10 г 0,ь-5-фенилгидантоина, при 40°С под слоем азота Y PP., Через 200 Ч выращивания при этих условиях осуществляют полный гидролиз с образованием аминокислоты(Гфенилглицин), что отмечено посредством поляриметрического анализа реакционной смеси и тонкослойной хроматографии (проведенной в соответствии с методикой, описанной Сузуки в Джорнал ов хроматографи 80, 1973,. 199204). О-фенилглицин выделяют из реакционной смеси путем осаждения белков с помощью трихлоруксусной кислоты и отделения их центрифугированием, при этом рН доводят до изоэлектрической точки 5,8. Осадок промывают водой и высушивают в вакууме. Идентичность 0-фенилглициновой аминокислоты подтверж дается инфракрасным спектром и спектром ядерного магнитного резонанса. .Удельная оптическая сила равна ( ( в 1 н растворе НС1) по сравнению с величиной D, равной -157,8 для чистой амин.окислоты (по литературным данным). П р и м е р 2. Клетки, полученные, как описано в примере 1, из 100 мл бульонной культуры суспендируют в 10 мл пирофосфатного буферт , iHoro раствора (0,1 М, рН - 7,7} и подвергают гомогенизации под воздействием ультразвука 10 мин при 5 С. Полученный гомогенат добавляют к 500 мл раствора Д, L-N-кapбaмилфeнилглиl инa (20 мл) в пирофосфатном буферном растворе (0,1 М, рН-7,7) выращивают при 65 С. Кинетику реакции контролируют путем отделения аммония, высвобожденного в процессе гидролиза N-карбамоила с использованием фенол-гипохлоридного метода. После выращивания в течение 40 ч NHt-ион достигает концентрации 10 млмоль/Л, дсшее увеличения не

наблюдается. Реакционную смесь концентрируют в вакууме при . до 100 мл. Добавлением НС1 рН доводят до 5,8 и осадок собирают на фильтрат.е, а затем его растворяют в 1 н растворе НС1, повторно осаждают с помощью Nci(7H при рН 5,8 и высушивают. Далее определяют оптическое вращение, которое равно - . Инфракрасный спектр подтверждает идентичность аминокислоты.

Из фильтрата, значение рН которого осторожно доводят до 2,5 добавлением Зн нормального раствора нее в ванне со льдом, получают осадок, который затем шлпаривают до сухого состояния и экстрагируют абсолютно 1КИПШЦИМ этанолом. После охлаждения используют спиртовой раствор, получая кристаллический осадок, который затем высушивают и исследуют методом тонкослойной хроматографии и инфракрасного спектра. Анализ подтверждает наличие чистого N-карбсииоилфенилглицина.

Удельное оптическое вращение равно ( 34° в 1 н растворе NaOH по сравнению с известным (данны литературы для U - энантиомера..

П р и м е р 3. Из предкультуры, полученной, как описано в примере 1, засевают пять колб по 500 мл, в каждой из которых содержится 100 мл среды, состоящей из 5%-ного раствора жидкости для замачивания зерна. Значение рН доводят едким натром до 7,8 и стерилизуют при 121°С 30 мин.

Культуру выращивают 24 ч при 30°С и перемешивании при 220 . Клетки отделяют центрифугированием, промывают пирофосфатным буферным раствором (0,1 М, рН 7,7), а затем суспендируют в 100 мл такого же буферного раствора, содержащего Юг 5-параокси-О,L-фенилгидантоина, и выращивают при 40с под слоем азота VPP. Через 160 ч выращивания осущестляется полный гидролиз с образованием аминокислоты (параоксифенилглицин -0(-)), что подтверждается полярометрическим исследованием реакционной смеси тонкослойной хроматографией по методике Сузуки.

Аминокислоту вьаделяют осаждением белков с помощью трихлоруксусной кислоты, которые затем удаляют центрифугированием при рН 5,2, доведенном до изоэлектрической точки. Осадок промывают водой и вьасушивают в вакууме.

Идентичность аминокислоты подтвердается на основании инфракрасного спектра и спектра ядерного магнитного резонанса. Удельное оптическое вращение равно(.с1lP -156 ,5 ( в 1 н растворе НС1) по сравнению с -161,2® для чистой аминокислоты по литературным данным).

П р и м р 4. Используют клетки штамма Agrobacteriurn, полученные из 100 мл бульонной культуры, содержа™ щей в основе жидкость для замачивания зерна и приготовленной, как описано в примере 1.

Пролитые клетки суспендируют в 10 мл пирофосфатного буферного раствора (0,1 М, рН 7,7)и модифицируют толуолом 15 мин при комнатной температуре и перемешивании. Суспензию

o добавляют к 500 мл раствора N-карбамоил-1,L-параоксифенилглицина 20 мм пирофосфатном буферном растворе (0,1 М, рН 7,7 и выращивают при 65 С под слоем азота VPP. Кинетику

5 реакции контролируют определением алвкюния, высвобождаемого в результате гидролиза К-карбамоильного производного в соответствии с методом фенол-гипохлорита, как описано в примере 1. Через 18 ч выращивания

0 NH -ионы достигают концентрации 10 млмоль/л. Реакционную смесь концентрируют в вакууме при до конечного объема 100 мл. Концентрированной НС1 рН доводят до 5,2

5 образовавшийся осадок собирают на фильтре.

i 0-аминокислоту и Ы-карбамоил-1 вьщеляют и идентифицируют, как описано в примере 2.

0

Удельное оптическое вращение равно -157,2° и +171° по сравнению с известньали значениями -161,2° и +175,4 для чистых продуктов (по литературным данным.

5

П р и м е р 5. Клетки штамма Адrobacterium sp. готовят, как описано в примере 1. Несколько грамм cycneVзии влажных клеток взвешивают в пирофосфатном буферном растворе (0,1 М,

0 рН 7,7} и обрабатывают ацетоном на холоде. Ацетон удаляют фильтрованием, ацетоновый состав высушивают в вакууме при 35С до постоянного ве са. Высушенный материал гомогенизируют в ступке и порошок используют

5 для испытаний ферментативной активности. Ацетоновый порошок анализируют на следующих субстратах: N-карбамоил-й {-)-аланин,Ы -карбамоил-D (-)валин, Ы-карбамоил-О (-)глутамино0вая кислота; М-карбамоил Ь-(-) параоксифенилглицин, М-карбамоил0 (-) парамётоксифенилглицин, N-карбамоил L(+)-фeнилглицин N-карбамоил- О{-)-фенилаланин N-карбамо5иЛ-С(+) - глутаминовая кислота и Nкарбамоил-О (-)(2-тиенил -глицин.

Таким образом, получают 20 мл раствора каждого карбамоильного производного в пирофосфатном буферном растворе 0,1 М, рН 7,7, после чего к 10 мл

0 каждого раствора добавляются соответствукядее количество порошка, одинаковое для каждого субстрата. Выращивание проводят под слоем азота VPP при 40°С и перемешивании в течение

5

1 ч; после чего измеряют количество образовавшейся аминокислоты, определяемое измерением в реакционных смесях концентрации NH -иона с помощью метода фенол-гипохлорида, как описано в примере 2.

При испытаниях за 100 принимают гидролитическую активность в отношении к N-карбамоил -D(-) -параксифенилглицина.

Результаты испытаний приведены в таблице.

Примере. Готовят культуральную среду следукнцего состава,г: MgSO. 0,2; Nan НРО. - 1 ZHI) 6; 3; NH4.C1 2; NaCL 0,5; глицерин - 5, 5-фенил-1),ь-гидантоин0,1; дрожжевой экстракт 0,1 и дистиллированная вода 1000 мл.

По 100 мл среды помещают в колбы 500 мл емкостью, стерилизуют при 30 мин. Гидантоин стерилизуют фильтрованием. ,

Из предкультуры, полученной, как описано в примере 1, засевают 5 мл на колбу, после чего эту культуру выращивают 36 ч при и перемешивании при 220 об/мин мешалки. Затем клетки отделяют центрифугированием и из надрсадочной жидкости выделяют аминокислоту путем ее концентрирования и доведения до изоэлектрической точки.

Из 10 л обработанного таким образом бульона получают 11,2 г D (-) фенилглицина с удельным оптическим вращением (d-)i -156° ( в 1 н растворе НС1) по сравнению с извесным, равным - 157,8для чистой аминокислоты (по литературным данным).

Пример. Готовят культуралную среду состава,г: MgSO. 0,2; .. 12Hij O 6; 3; 5-метил-гидантоин 2, NnCe 0,5, глюкза 1; дрожжевой экстракт 0,1 и дист лированная вода 1000 мл) рН 7.

Наименование субстрата

Ь(-)-аланин

N-Карбамоил0.(-)-валин N-КарбамоилD(-)глутаминовая М-КарбамоилL(+)глутаминовая N-КарбамоилD(-)-параметокси Н-КарбамоилО(-)-фенилглицин N-Карбамоил1(+)-фенилглицин N-Карбамоилч

D(-)-(2-тиенил)г N-Карбамрил. D(-)-фен илаланин N-КарбамоилКультуральную Ъреду порциями по 100 мл помещают в колбы емкостью 500 мл, стерилизуют при 116°С 20 мин, метилгидантоин стерилизуют отдельно.

с из предкультуры, полученной, как описано в примере 1, высекают по 5 мл на колбу, после-чего культуру выращивают при и перемешивании при 220 об/мин мешалки в течение 24 ч.

Клеточную суспензию отделяют центрифугированием из 100 мл среды, промывают в фосфатном буферном растворе (рН 7,5) и повторно суспендируют в 100 мл такого же буферного раствора, содержащего 4 г D ,L-5- 2-тиенил -гидантоина.

Реакционную смесь выращивают под слоем азота YPP при 40°С. Через 30 ч реакции гидролиз завериается с образованием aминoкиcлoтыБC- -(2тиенил-глицеряна, которую выделяют путем концентрирования реакционной смеси до объема 20 мл и рН до 5,6.

Идентичность аминокислоты подтвеждается инфракрасным спектром и спектром магнитного резонанса. ,

Удельное оптическое вращение(«1г -72,6° ( в ) по сравнению с -73,7° для чистой аминокислоты (по литературным данным).

Таким образом, штамм Agrobacterlum продуцирует ферментный комплекс, который вызывает как гидролиз гидантоина до карбамильного производного целевой аминокислоты, так и гидролиз такого производного в соответствующую D -аминокислоту.

Предлагаемый способ получения Dфенилглицина и его производных обеспечивает получение последних одностадийно, что упрощает процесс, по сравнению с известными решениями той же задачи.

Активность,%

57,5

34,25

21,7

О

100,0

81,25

О

40,7

50,0

Ы-Карбамоил-О (-) - паратоксифени51глицин

40,0

9884576 10

Формула изобретенияна и его производных осуществляют

Способ полученияD-фенилглицина11291.и..его п)оизводных путем ферментатив-Источники информации,

(Нбго гидролиза рацематов 5-фенилгидан-тгринятые во внимание при экспертизе,

тоина и его производных, о т л и-5 1. Патент Японии 45-8635,

ч щ и и с я тем, что, с цельюкл. С 12D 13/06, опублик.1970.

упрощения процесса. Ферментативный2, Патент СССР по заявке

гидролиз рацематов 5-фенилгидрантои- 2381854/28-13, 1976.

штаммом Agrobacterfurn sp. NRRL В