Штамм АсINетовастеR @ р.-продуцент гидролазы N-карбамоил-5-фенилглицина Советский патент 1990 года по МПК C12N9/16 C12N1/20 

(Л

с:

Изобретение относится к микробиологической промышленности, в частности к получению штамма-продуцента гидролазы N-карбамоил-5-фенилглицина, который может быть использован для получения D-фенилглицина, необходимого для производства синтетического антибиотика ампицилина. Цель изобретения - получение штамма, обладающего более высокой активностью гидролазы N-карбамоил-5-фенилглицина. Штамм ACINETOBACTER SP. ВКПМ В-4388 выделен из почвы. Штамм синтезирует фермент с активностью 49,8±0,7 мкмоль^.мин^-1 г^-1 при 40°, концентрации субстрата 5 мкл в 0,1 М фосфатном буфере, PH 7,25. 1 табл.

Изобретение относится к микробиологической промьшшенности, в частности к получению нового штамма - продуцента гидропазы Ы-карбамоил-5- фенилглицина, который может быть использован для получения D-фенилглицина.

Цель изобретения - получение штамма с более высокой активностью гидролазы К-карбамоил-Б-фенилглицина.

Штамм Acinetobacter sp. ВКПМ В-4388 (М4) выделен из почвы. Выделение карбамоилазного продуцента проводили в 3 этапа.

Пробы иа природных источников культивировали при три недели в ка- чалочных колбах с селективной средой (пересевы делали через неделю) следующего состава, г/л: П-карбамоилфенил- rjTHitHH 1; Mp,S04- 7HiO 0,2; , 1; ,

Мп Cl.j-4H,0 0,01; CaClj 2K2b 0,02; рН 7,0. Полученную смесь, богатую микроорганизмами, способными усваивать Р-карбамоилфенилглицин, высевали в чашки Петри с агаризованной средой такого же состава. При пересевах отдельных колоний получили 43 чистые микробные культуры, которые использовали для определения карбамо- илазы./

Чистые культуры культивируют в качалочных колбах с жидкой питатель А ной средой следующего состава, г/л; мясной экстракт 1; дрожжевой экстракт 2; пептон 5; NaCl 5; Г)-карбамо- илфенилглицин 1. После суточной инкубации- при биомассу центрифугируют, лиофилизуют. 20 мг сухих клеток инкубируют с 1,5 мл 0,5%-ного

:л

со со

Р-карбамоилфенилглицина в 0,1 М фосфатном буфере (рН 8,0).при в течение 60 мин на магнитной мешалке В начале и в конце реакгщи берут пробы по 5 мкл и наносят на хромато- графическую пластинку с силикагелем, В качестве контрольного раствора берут 5 мкл О,1%-ного фенилглицина в 0,1 М фосфатном буфере,, Хромато- графическую пластинку высушивают и погружают в носитель (1:4 :Et он). Проявляют опрыскиванием 0,5%-ным спиртовым раствором нингид- рина. Образование фенилглицина обна- .ружено у 18 бактериальных культур.

Определение проводят по методике, отработанной в лаборатории техноло- гии биокаталитических процессов НПО Фермент.Спектрофотометрически кар- бамоилазную активность показали 8 .культур. Наиболее активный штамм jAcinetobacter sp. М4 имеет показа- тели активности 49,8JO,7 мкмоль/мин-г.

Морфологические признаки: палочковидные клетки размером 1,0-1,5 мкм. одиночные или парами, неподвижные, грамотрицателБНые, спор не образует,

Физиологические признаки: колонии на МПА после суточной инкубации при рН 7,0 непигментированные, блестящие, выпуклые, край ровный, размер 1-2 мм; при 25 и 45°С рост ела- бый; Сахаров до кислйк продуктов не метаболизирует, жепатину не pai-шижа- ет, крахмал не гидролизует, молоко не свертьгоает, на картошке не растет нитра гов не усваивает; из источников азота лучше всего использует пептон, гидролизат дрожжей. Культура хранится в лиофилизированном состоянии в ампулах. .

Пример. Биомассу штамма Aci- netobacter sp. М4 получают при выА Д1 -У 1 (у -2. + УЗ ),(.

где.лП - разница оптической плотное- ти во время реакции Jt (в дном случае 10 мин);

m - количество клеток, г;

- молярный коэффициент экстин Kijfm продукта реакции с ., 4,6-тринитробензолсульфокис лотой, 9400 м- -см - ;

V - объем инкубируемого раствора, мл;

ращивании в качалочных колбах объемом 750 мл (количество среды 100 мл) при 37 Г с .40 об „/мин. Используют питательную среду следующего состава, г/л: мясной экстракт 1; гидролизат дрожжей 2; пептон 5; натрий хлористый 5; N-карбамоипфенилглицин 1; рН 7,0. После стерилизации при , 30 мин петлей засевают суточную культуру. Колбы инкубируют на качалках 20 ч. Биомассу отделяют центрифуги- оанием при 10 000 об./мин, промыват 0,8%-ным раствором хлористого натия и лиофильно высуишвают,

Карбамоилазную активность измеряют по начальной скорости образования фенилглицина, определяемого по цветной реакции с 2,4,6-тринитробензол- сульфокислотой. Для этого проводят ферментативный гидролиз при 40°С в тёрмостативных кюветах при интенсивном перемешивании на магнитной мешалке. Берут 20 мг (т) сухих клеток, добавляют 1,5 мл (v,) 0,5%-ного D-кар- бамоилфенилглицина, растворенного в 0,1 М фосфатном буфере (рН 7,25), Из перемешиваемой магнитной мешалкой смеси после 5 и 15 мин от начала реакции отбирают пробы объемом по 0,01 мл (.v и вливают в пробирки с 2,5 мл (v) боратно-фосфатного буера (7,6 г Na,В 407- ЮН,0/1 л + ,, концентрированный раствор о-рН 8,5), Смесь центрифугируют 10 мин при 10 000 об,/мин. Осторожно берут 2 мл (v) надосадочной жидкости и добавляют 0,1 мл (v) раствора 0,7%-ной 2,4,6-тринитробензол- сульфокислоты. Инкубируют 30 1.ШН при 40°С. Разницу оптической плотности C3D) между пробами определяют при 420 км Спектрофотометрически.

Карбамоилазную активность вычисляют по формуле

5-) -1403,

S МКМОЛЬ/МИН Г ,

в таблице приведены данные о кар- бамоилазной активности штамма Aci- netobacter зр„ М4 и прототипа - АЯГО- bacteriuin radiobacter.

Формула изобретения

Штамм Acinetobacter sp.BKITK В-4388 - продуцент гидролазы К-карбамоил-5-фе- нилглицина,

Продуцент

:Acinetobacter sp. 49 810 7

Agrobacterium radiobacter 12 3

Приведено стандартное отклонение 3 опытов (в колбах),

Значение вычислено из кинетических данных по образованию D-фенилглицина

Карбамоилазная активность, мкмоль