Способ получения оптически активных АМиНОКиСлОТ Советский патент 1981 года по МПК C12P13/04 

(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ОПТИЧЕСКИ АКТИВНЫХ DL-АМИНОКИСЛОТ

остающимися клеtKaiVfn цпя чего в проойрку с 10 лад фосфатного буферного раствора 0,07 М, р11 8 с 20 мкмоль/мл5-(0,д-фенилгидантоииа прибавляют i мл бактериальной суспензии ( вес около 50 мг/1гуш) После 30 мин выдержки в термостате при 30 С проводят реакцию с п-диметиламинбеизальдегидом для ко.шчественггого определения образовавшегося карбамз-шьного производного.

Используют штаммы Pseudomonas sp. 942 или 945, а также ряд других этого рода, полученные из Центрального .бюро грибковых культур, где им присвоены символы СВ 14575 и 14675 соответственно. Бактериальные штаммы (табл.1) хорошо растут на всех обыодых лабораторных средах, способны нотреблять гидантоии в качестве единственного источника азота. Рост наблюдается при 5 - 40°С, оптима71ьные пределы 26--30°С.

Штаммы классифицированы по генетическому принципу. Их характеристика представлена втабл. 2.

Гидролиз гидантоинов происходит не только в присутствии микроорганизмов ivw незатронутых их клеток, но также и в экстрактах этих микроорганизмов, которые могут быть культивированы, например, в яшг.ской питательной среде для получе1шя гидролазы в клетках и DL-гидантоины могут быть 1юс.л этого прибавлены к культуре. Энзиматическая ферментативная реакция может быть .также проведена в отсутствии гак наэглвасмых покоящихся клеток. В этом случае бактериальные клетки выделяют нз культуральной среды, П1зо.мывают и сус.пендируют в забуференной среде, к .которой прибавлен раделшческий гидантоин. Могут быть использованы также препараты, содержащие гидролазы, такие как экстракты или коицентратЬ, сьгрые или очищенные препараты гидролазы, полученные из клеток микроорга шзг,тов (табл. 1). Можно, использовать также иммобилизованные ферменты.

и р и м е-р 1. К 100 мл бульонной културы в среде штамма Pseudomonas sp. 942 в колбе объемом 500 ivm прибавля-ют, на 24 ч выдерижи в термостате (перемешивание вращением) при 30° С 100 iv-m фосфатного буферного раствора (0,14 М) с рН 8,5, который содержал, 30 мкмоль/мл 5(D,L)-фe нилгидантоина. После 5 ч выдержки в термостате в тех же условиях определяют образовавшийся М-карбомилфён1шглицин. Из 530 м 5-(D 1.)-фенилгидантоина получают 525 мг М-карСамилфенилглйцина, что соответствует примерно 90%-ному выходу.

П р и м е р 2. К бульонной культуре, которая приготовлена с описанным, выше составом, прибавляют 1 г/л 5-(0,1)-метилп данТОНН. рН устанавл.йвают на уровне 7,2 добавлением Waj СОз и среду распределяют по 50 мл в колбы объемом 250 мл. После 30 мин стерилизации при 110° С содержимое колб инокулир тот культурой Pseudomonas sp. 942 с пластинки, которая содержит ту же среду вместе с 2% агар-агара (Difco) и выдерЖ1гвают в термостате 20 ч при температуре 30° С и перемешивании вращением (220 об/ми С помощью предварительно приготовленной культуры (оптическая плотность при 550 нм 0,400; степень разбавления 1:10) инокулируют 5 мл в колбах объемом 500 мл, которые содержат 100 мл той же среды и выдерживают в термостате при 30°С и перемешивании 18 ч (последняя фаза экспоненциального роста) , riocjje, этого клетки собирают путе.м центрифугирования и промывают 3 порциями забуферешюго физиологического раствора, сус17е.1 /тиру1от в буферном растворе соли-фосфата, 0,074 М, рН 8.5 (покояа иеся клетки). Дня проведения ферментативного (энзимагического) гидролиза в колбах объемом 250 м выдерживают в термостате при 30° С и перемешивании 64 Mjt бактерий (сухой вес) и 20 мк.моль/мл 5-(0,1)-фенилгидантоина (3,52 мг/мл). Через различные промежутки времени про.дукт гидролиза, т.е. D-карба:.; ; ;ш;лглицин, определяют калориметри..еским методом при длине волны 438 им.

Примерз. Готовят среду следующего состава;

Двузамещенный фосфат натрия WajHPO, г/л7,5

Двузамещенный фосфат калия КН2РО4, г/л. 2,72

Сульфат аммония.

(N144)2804, г/л5,0

Сульфат магния

MgSO4, г/л0,2

Сульфат дву.чвалентного марганца MnS04, г/мл0,45 FeS04 -71-120, г/мл5,5 Глюкоза, г/л .10,0 Экстракт дрожжей, г/л 0,2 5-(0,Ь)-Мет И1Гидантоин. г/л . 1,0

Среду разливают по 50 мл в колбы объемом 250 мл и по 100 мл в колбы объемом 500 .мл, стерилизуют 30 мин при 110°С. Содержимое .колб ипокулируют срезом с пластш{, на которых находится культура щтамма Pseudomonas sp. 942 и выдерживают в термостате, 24 ч при 30° С. Из этой культуры (оп-п.ческая плотность при длине волны 550 нм 0,245; степень разбавления 1:10) инокулируют 5 мл в колбы объемом 500 . После выдержки 19 ч в термостате при 30° С получают покоящиеся клетки.

Ферментативный гидролиз проводят при в реакционной среде, содержащей 64 мл буфера, 280 мг бактерий (из расчета на сухой вес) и 20 мкмоль/мл 5-{0,и)-фешшгидантоина. Через 5,10 и 15 мин определяют количество образовавшегося карбамильного производного, которые составляют 1,15; 2,05 и 3,00 соответственно.

П р и м е р 4. Бактериальные клетки готовят из штамма Pseudomonas sp. 942 аналогично примеру 2. Суспензии клеток 42 мг/мл (из расчета на вес сухих бактерий) в буферном растворе соли-фосфата 0.1 М, рН 8, подвергают механическому разрушению в гомогенизаторе Мант-Гаулин под давлением850 кг/см и телшературе ниже 24° С. Экстрак отделяют центрифугированием. К 950 мл фосфатного буферного раствора (рН 7,7), содерхсашего 2,12 г 5-{0,1)-фенилгидантоина приШтамм

Являют 50 мл экстракта, содержащего 8500 ед. фермента, выдерживают 1 ч при 30° С. Получают 1,7 D-карбамнльного производного (80% от теории).

П р и м е р 5. Аналогично примеру 4, к 993 мл субстрата прибавляют 7 мл экстракта, который предварительно подвергают семикратной чистке. Через 1 ч при 30° С образовывается 1,7 г О-карбамильного производного (примерно 80% от теории).

П р и м е р 6. Аналогично примеру 2, получают после .30 мин вьшержки при 30° С со игтаммом Pseudomonas sp. 945 и 352 мг 5-(О,Ь)-феш1лп1дантоина 220 мг карбамилфенилглицина (примерно 57% от теории).

Предлагаемый способ обеспечивает получение D-амннокислот в промышленном масштабе, снижение затрат на их производство, а также увеличение выхода продукта с повьшюнной оптической чистотой.

Таблица I

N-карбамилфеинлглицкн, % от теоретического выхода

Pseudomonas sp.

Pseudomones fluorescens

Pseudomonas sp. Pseudomonas ATCC

Pseudomonas oleovorans CL

41

50

17

Pseudomonas desmoiyticum NCIB

8859

Pseudomonas

11250

f luoroscens ATCC Pseudomonas putida ATCC 12633

Подвижность Пспожение спор , Набухание спорангий

Форма спор

Максимальная темпераTjpa роста, °С

Минимальная температура роста, °С

Гидролиз крахмала

Желатины

Казеина

Индол

Отношение к нитратам и нитритам- (

Уреаэа

Рост в хлориде натрия 2%-ном

3%-ном 5%-ном Каталаза Анаэробиоз

Щелочная реакция в У-Р бульоне

8100828

, Продолжение табл. 1

25

25 14

Таблица 2

Предконцевое

4

Эллипсоидная 50-55 30

+ f

+

+

+ +

9810082JO

Формула изобретениятивный гидролиз гидантоиновых производных

Ооособ получения оптически активных DL-monas sp. 942 или 945.

аминокислот путем ферментативного гидроли-.Источники информации,

за пшантоиновых производных, отличаю-j принятые во внимание при экспертизе

щ и и с я тем, что, с целью повышения выхода1. Патент Японии N 4S-863S, к л. С 12 D 13/16,

и удешевления целевого продукта, фермента-опублик. 1970.

аминокислот осуществляют штаммами Pseudo-