Способ детекции ионов меди в окружающей среде и биосенсор для его осуществления Российский патент 2017 года по МПК C12M1/40 C12Q1/02 C12N1/21 C12R1/19 

Область техники

Изобретение относится к области охраны окружающей среды, а именно к способам и устройствам для экспресс-анализа проб на наличие ионов меди, а также к биосенсорам на базе микрожидкостных систем, проводящих химикобиологическую детекцию с использованием малых объемов жидких реагентов и бактериальных клеток, выступающих как биоселективный элемент биосенсора.

Уровень техники

Известны способы определения загрязнителей в окружающей среде химическими методами [Лурье Ю.Ю. Аналитическая химия промышленных сточных вод. М.: Химия, 1984. 448 с.; Практикум по агрохимии / Под ред. В.Г. Минеева. М.: Изд-во МГУ, 2001. 689 с.]. Данные методы основаны на определении загрязнителей в среде с помощью спектрофотомерии, атомно-абсорбциононной спектрофотомерии, высокоразрешающей хроматографии с масс-спектрометрическим детектированием и др. Недостатком данных методов является необходимость использования дорогостоящей аппаратуры, а также сложность проведения анализа в полевых условиях.

Известен способ, где [Патент US №6329160, 12.11.2001] предлагается в качестве основы биосенсора использовать клетки генномодифицированной бактерии E. coli, содержащей luxCDABE-гены, находящиеся под контролем регуляторных элементов оперона/гена деградации толуола. При этом по изменению интенсивности свечения клеток бактерий в биосенсоре возможна оценка концентрации в среде бензола, толуола, ксилола. С помощью соответствующих генетических конструкций в генномодифицированных клетках бактерий предлагается измерять концентрацию в среде взрывчатых веществ [Патент US №5972638, 26.10.1999], органических и неорганических соединений мышьяка [Патент ЕР №1367134, 12.03.2003], детергентов [Патент РФ №2355760, 20.05.2009], гептила [Патент РФ №2297450, 20.04.2007] и ионов тяжелых металлов [Патент US №8697388, МПК C12Q 1/02; G01N 33/20, опубл. 15.04.2014]. Последний взят нами за прототип для способа. Предложен состав биосенсоров, содержащих бактериальные клетки, и способы обнаружения некоторых тяжелых металлов.

Биосенсоры на основе генетически модифицированных бактериальных клеток Caulobacter crescentus, содержащих ген, кодирующий репортерный белок (зеленый флуоресцентный белок (GFP). Данный ген экспрессируется в присутствии ионов тяжелых металлов.

Недостатком способа прототипа является трудоемкость и продолжительность процесса, при этом гибель клеток из-за присутствия токсичных веществ может вызывать ошибку измерения концентрации тяжелых металлов в растворе.

Задача, на решение которой направлена группа изобретений, заключается в разработке биосенсора, состоящего из генномодифицированных клеток бактерий и микрожидкостного устройства как платформы, на которой осуществляется процесс детекции, а также расширение арсенала средств для определения ионов меди в окружающей среде.

Поставленная задача решается с помощью предлагаемого в п. 1 формулы изобретения биосенсор для детекции ионов меди в анализируемой жидкой среде, который включает корпус (1) из прозрачного материала, такого как пластмасса или стекло, или полидиметилсилоксан, с микроканалами (2) для анализируемой жидкой среды, причем внутри микроканалов выполнены ловушки, представляющие собой заграждение в виде ряда микропилларов (3), в которых иммобилизованы агарозные сферы (5), содержащие генномодифицированные клетки бактерий Escherichia coli BL21 DE3 pClcRFP, представляющие собой биоселективный элемент, способный к синтезу флуоресцентного белка RFP.

Особенности выполнения биосенсора нашли отражение в пунктах 2-3 формулы изобретения, а именно: Биосенсор включает три микроканала с 10 ловушками в каждом, а ряд микропилларов (4) выполнен в форме подковы.

Поставленная задача решается с помощью признаков, указанных в пункте 4 формулы изобретения, общих с прототипом, таких как способ детекции ионов меди в анализируемой жидкой среде с помощью биосенсора по пп. 1-3, характеризующийся тем, что клетки бактерий Escherichia coli BL21 DE3 pClcRFP иммобилизуют в агарозные сферы с диаметром от 50 до 70 мкм, помещают их в ловушки биосенсора, осуществляют подачу анализируемой жидкой среды в биосенсор, измеряют свечение агарозных сфер с помощью флуоресцентного микроскопа с камерой или флуориметра, после чего полученные в анализируемой жидкой среде результаты обрабатывают и сравнивают с контрольными, при этом контрольными считают результаты флуоресцентного свечения агарозных сфер в ловушках до заполнения их анализируемой жидкой среды для детекции.

Поставленная задача решается согласно п. 5 формулы изобретения, а именно с помощью штамма бактерий Escherichia coli BL21 DE3 pClcRFP, представляющего собой биоселективный элемент для детекции ионов меди.

Преимуществом предлагаемого способа детекции является использование вновь созданного компактного, миниатюрного биосенсора, содержащего внутри генномодифицированные клетки бактерий; снижение объема анализируемой жидкой среды (до 1 микролитра), который требуется для введения в устройство (на 1 ловушку микрожидкостного чипа необходимо до 40 нанолитров); уменьшение количества генномодифицированных клеток бактерий (до 3×10⁵), необходимых для анализа одной пробы; снижение времени детекции до 10 минут.

Технический результат, который может быть получен при использовании предлагаемой группы изобретений, заключается в том, что детекция, проводимая на биосенсоре, позволяет обнаружить наличие ионов меди в среде и оценить степень загрязненности среды с использованием малого объема пробы, вводимой в биосенсор, и малого количества генномодифицированных клеток бактерий, необходимых для детекции одной пробы. Различия в объеме пробы и количестве генномодифицированных клеток бактерий, используемых для работы биосенсора, между предлагаемым изобретением и ранее созданными аналогами, в т.ч. прототипом, составляют до 10 и более раз.

Изобретение иллюстрируется следующими чертежами.

На фиг. 1 представлен эскиз общего вида корпуса биосенсора (позиция 1) с тремя микроканалами (позиция 2) по 10 ловушек в каждом микроканале (позиция 3).

На фиг. 2 представлен увеличенный эскиз одной ловушки биосенсора, выполненной в виде микропилларов (позиция 4) диаметром 40 мкм расположенных в форме подковы с расстоянием менее 40 мкм между микропилларами таким образом, что общий объем одной ловушки не превышает 40 нл. В центре ловушки размещены агарозные сферы с клетками бактерий (позиция 5).

На фиг. 3 представлена фотография оптического изображения одной ловушки биосенсора с агарозными сферами, содержащими генномодифицированные клетки бактерий (позиция 4).

На фиг. 4 представлена фотография флуоресцентного изображения ловушки биосенсора в начальный момент детекции и спустя 10 минут.

На фиг. 5 представлен график зависимости ответа биосенсора на основе клеток бактерий Escherichia coli BL21 DE3 pClcRFP от содержания ионов меди в пробе.

Осуществление изобретения

Биосенсор (фиг. 1) выполнен в виде микрожидкостного устройства, содержащего корпус 1 из прозрачного материала с микроканалами (2) для анализируемой жидкой среды, внутри которых выполнены ловушки (3) для агарозных сфер (5) (фиг. 2 и 3), содержащих генномодифицированные клетки бактерий Escherichia coli BL21 DE3 pClcRFP (биоселективный элемент) (фиг. 3), способные к синтезу флуоресцентного белка.

Корпус (1) выполнен из пластмассы или стекла, или полидиметилсилоксана.

Корпус биосенсора выполнен с тремя микроканалами (позиция 2 фиг. 1) по 10 ловушек в каждом.

Ловушки представляют собой заграждение в виде ряда микропилларов (5) в форме подковы.

Иммобилизованные агарозные сферы (5) используют диаметром от 50 до 70 мкм. Как для способа, так и для биосенсора, в качестве биоселективного элемента для детекции ионов меди, используют штамм бактерий Escherichia coli BL21 DE3 pClcRFP.

Осуществление группы изобретений заключается в том, что для детекции загрязненности среды используют оптически прозрачный корпус биосенсора с микроканалами, по которым подается анализируемая жидкая среда. Внутри микроканалов имеются специально сконструированные ловушки для агарозных сфер диаметром от 50 до 70 мкм. Агарозные сферы содержат в себе генетически модифицированные клетки бактерий (биоселективный элемент), способные к синтезу флуоресцентного белка. При взаимодействии клеток бактерий, заключенных в агарозные сферы, с анализируемой жидкой средой происходит изменение интенсивности флуоресцентного свечения.

Пример 1. В качестве примера использованы генномодифицированные клетки Escherichia coli BL21 DE3 pClcRFP, несущие в геноме репортерное clc::rfp-слияние, способные к продукции флуоресцентного белка RFP (длина волны света возбуждения флуоресценции - 585; длина регистрируемой волны - 610) для определения в среде ионов меди. Синтез RFP белка в клетках Е. coli BL21 DE3 («Stratagen», США), трансформированных плазмидой pClcRFP, созданной на основе вектора pGEM-T («Promega», США), происходит в результате ИПТГ-зависимой активации транскрипции с T7_lac-промотора. Под этот промотор, лежащий перед полилинкерным участком плазмиды pGEM-T, введено трансляционное слияние промоторной области clc-оперона с беспромоторным геном красного флуоресцентного белка RFP. При периодическом культивировании клеток Е. coli BL21 DE3 pClcRFP в экспоненциальной фазе в культуру вводится неметаболизируемый аналог лактозы ИНН, что приводит к наработке ClcA::Rfp-гибридного белка и накоплению его в цитоплазме. Затем бактериальные клетки включают в состав агарозных сфер и помещают в ловушку микрофлюидного чипа, где RFP белок уже и подвергается воздействию ионов меди, что приводит к детектируемому изменению его флуоресценции.

Пример 2. Для определения ионов меди в анализируемой жидкой среде культуру клеток Е. coli BL21 DE3 pClcRFP выращивали с единичной колонии на среде LB в присутствии 100 мкг/мл ампициллина в течение 18 часов при 37°C с аэрацией на термошейкере при 100 об/мин. Рост культуры оценивали на спектрофотометре UV-Visible BioSpec-mini («Shimadzu», Япония), определяя оптическую плотность при длине волны 600 нм в кюветах с длиной оптического пути 1,0 см. Оптическая плотность культуры составляла 1,5 о.е. (около 4×10⁹ клеток бактерий на 1 мл среды).

В дальнейшем культуру клеток отмывали дважды физиологическим раствором. Полученный клеточный осадок ресуспендировали в 1 мл физиологического раствора. Конечная оптическая плотность клеточной суспензии составляла около 150 о.е. (около 4×10¹¹ клеток бактерий на 1 мл среды).

Затем проводили инкапсуляцию полученной суспензии репортерных клеток в агарозные сферы с последующим их фракционированием до размера 50-70 мкм.

Штамм Escherichia coli BL21 DE3 pClcRFP отличается следующими признаками: Грамотрицательные палочки. Перитрихи. Колонии на питательном агаре правильной округлой формы с ровными краями, плоские, полупрозрачные, бело-серого цвета, при длительном культивировании слегка красноватые, консистенция мягкая. Выделяемый в среду пигмент отсутствует. Факультативный анаэроб. Клетки способны расти как на полноценных питательных средах (Luria-Bertani, мясо-пептонный бульон), так и на синтетических (среда М-9 с глюкозой, лактозой, ацетатом, сукцинатом и другими сахарами или короткоцепочечными органическими кислотами в качестве единственного источника углерода и энергии). Устойчивы к ампициллину вследствие наличия в плазмиде гена bla. Является коммерческим штаммом BL21 DE3, трансформированным рекомбинантной плазмидной ДНК pClcRFP. Трансформация штамма Е. coli BL21 DE3 («Stratagen», США) плазмидой pClcRFP, полученной на основе плазмиды pGEM-T («Promega», США), в которую был клонирован участок clc-оперона Rhodococcus opacus 1СР, слитый с геном красного флуоресцентного белка rfp. Хранение на скошенном LB-агаре под вазелиновым маслом - до полугода, в столбиках полужидкого агара - до года. Необходимы периодические пересевы. Возможно замораживание на -70°C в 10-20% растворе глицерина.

Пример 3. Инкапсулирование бактерий

1. В микроцентрифужную пробирку (объемом 10 мл) добавляли при непрерывном перемешивании на приборе Vortex V-1 plus («BioSan», Латвия) 200 мкл бактериальной культуры, 30 мкл 10% плурониковой кислоты («Sigma», США), 1 мл 2% TopVision агарозы, («Thermo Scientific)), США) температура, которой не превышала 39-40°C.

2. Полученную суспензию замешивали 1-2 минуты в однокомпонентном масле вязкостью 60-110 мПа×с, капая по 10-20 мкл суспензии.

3. Пробирку помещали в водно-ледяную баню на 5 минут.

4. Образовавшиеся агарозные сферы собирали центрифугированием 2200 об/мин 10 минут, с последующей промывкой физиологическим раствором.

Фракционирование полученного материала осуществляли с помощью фильтрования через нейлоновые фильтры с размерами пор 70 и 50 мкм («BD Falcon», США).

Готовые агарозные сферы с бактериальными клетками были иммобилизованы в ловушки биосенсора следующим образом.

1. Шприц заправляли физиологическим раствором, содержащим агарозные сферы.

2. Шприц устанавливали в систему дозирования TS-1B/W0109-1B («Baoding Longer Presion Pump Co., Ltd», Китай) и соединяли при помощи тефлоновой трубки (внутренний диаметр 100 мкм) с биосенсором.

3. Биосенсор помещали под микроскоп для визуального контроля заполнения агарозными сферами ловушек.

4. Устанавливали расход жидкости на системе дозирования TS-1B/W0109-1B в 1,5 мкл/мин.

5. Отслеживали заполнение сферами ловушек биосенсора.

Устройство работает следующим образом.

1. В микроканалы (2) биосенсора подают анализируемую жидкую среду на выявление наличия ионов меди.

2. Измеряют свечение агарозных сфер (5) в ловушках (3) микрожидкостного чипа (1), содержащих генномодифицированные клетки бактерий. Для измерения свечения используют флуоресцентный микроскоп с камерой или флуориметр.

3. Полученные результаты в исследуемых образцах обрабатывают и сравниваются с контрольными. Контрольным считается флуоресцентное свечение агарозных сфер в ловушках биосенсора до заполнения анализируемой жидкой средой.

На фиг. 5 представлены зависимости ответа биосенсора на основе клеток бактерий Е. coli BL21 DE3 pClcRFP от содержания ионов меди в пробе. Флуоресценцию измеряли с помощью микроскопа Nikon LV100D («Nikon», Япония). Изображение фиксировали при помощи видео/фотокамеры DS-Fil Nikon, интегрированной с микроскопом, до внесения растворов CuSO₄ и через 10 мин. Расчет флуоресценции проводили с использованием программного обеспечения NIS-Elements BS («Nikon», Япония), яркость флуоресценции сфер с клетками бактерий выражали в условных единицах свечения (УЕС).

Для оценки жизнеспособности бактериальных клеток в агарозных сферах использован набор красителей Live/Dead BacLight Bacterial Viability kit («Invitrogen», США). Известно, что токсическое действие ионов меди обусловлено, прежде всего, образованием связи с SH-группами аминокислотных остатков белков [Лужников Е.А., Костомарова Л.Г. Острые отравления. М.: Медицина, 1989. 419 с.; Maksymiec W. Effect of copper on cellular processes in higher plants // Photosynthetica, 1997, V. 34, P. 132-342]. В результате этого происходит изменение конформации белков и потеря выполняемой ими функции, в частности, происходит снижение флуоресценции RFP белка, продуцируемого бактериями Е. coli BL21 DE3 pClcRFP. Ответ на наличие тяжелых металлов (в том числе и меди) в среде, демонстрируемый биосенсором, предложенным ранее [Патент US №8697388, 15.04.2014], основан на индукции ионами тяжелых металлов синтеза в клетках генномодифицированной бактерии Caulobacter crescentus зеленого флуоресцирующего белка (GFP) и на измерении свечения клеток. В данном случае гибель клеток из-за присутствия токсичных веществ в растворе будет снижать свечение клеточной культуры, что будет вызывать ошибку в измерении концентрации ионов тяжелых металлов. Так как ответ биосенсора, предлагаемого в данной заявке, основан на действии ионов меди на белок RFP, нахождение клеток бактерий Е. coli BL21 DE3 pClcRFP в жизнеспособном состоянии для работы биосенсора не является необходимым условием. Например, введение в чип 75% этанола вызывало гибель около 90% клеток, но не снижало их флуоресценцию (данные не представлены).

Таким образом, наличие токсичных веществ в анализируемой жидкой среде не оказывает влияния на работу биосенсора на основе клеток бактерий Е. coli BL21 DE3 pClcRFP, в отличие от биосенсоров, предложенных в прототипе. Кроме того, время ответа ранее разработанного биосенсора [Патент US №8697388, 15.04.2014] составляет от 2 часов и более, а время ответа предлагаемого биосенсора на основе клеток бактерий Е. coli BL21 DE3 pClcRFP составляет 10 минут.

Изобретение создано в результате работ, выполненных по проекту в рамках реализации ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2014-2020 годы», соглашение №14.574.21.0028 от 17.06.2014 (уникальный идентификатор RFMEFI57414X0028).

Группа изобретений относится к области биохимии. Предложен штамм бактерий Escherichia coli BL21 DE3 pClcRFP для детекции ионов меди, биосенсор и способ детекции ионов меди в анализируемой жидкой среде. Биосенсор включает корпус с микроканалами для анализируемой жидкой среды, внутри микроканалов ловушки в виде ряда микропилларов с иммобилизованными агарозными сферами. Причём агарозные сферы содержат способные к синтезу флуоресцентного белка RFP генномодифицированные клетки бактерий Escherichia coli BL21 DE3 pClcRFP. Способ осуществляют с помощью вышеуказанного биосенсора и включает иммобилизацию клеток бактерий Escherichia coli BL21 DE3 pClcRFP в агарозные сферы с диаметром от 50 до 70 мкм, помещение их в ловушки биосенсора, подачу анализируемой жидкой среды в биосенсор, измерение свечения агарозных сфер, обработку и сравнивание результатов с контрольными. Изобретения обеспечивают обнаружение ионов меди в среде и оценку степени загрязнённости с использованием малого объёма пробы и малого количества генномодифицированных клеток бактерий, необходимых для детекции одной пробы. 3 н. и 2 з.п. ф-лы, 5 ил., 3 пр.

1. Биосенсор для детекции ионов меди в анализируемой жидкой среде, отличающийся тем, что включает корпус (1) из прозрачного материала, такого как пластмасса или стекло, или полидиметилсилоксан, с микроканалами (2) для анализируемой жидкой среды, причем внутри микроканалов выполнены ловушки, представляющие собой заграждение в виде ряда микропилларов (3), в которых иммобилизованы агарозные сферы (5), содержащие генномодифицированные клетки бактерий Escherichia coli BL21 DE3 pClcRFP, представляющие собой биоселективный элемент, способный к синтезу флуоресцентного белка RFP.

2. Биосенсор по п. 1, отличающийся тем, что включает три микроканала с 10 ловушками в каждом.

3. Биосенсор по п. 1, отличающийся тем, что ряд микропилларов (4) выполнен в форме подковы.

4. Способ детекции ионов меди в анализируемой жидкой среде с помощью биосенсора по пп. 1-3, характеризующийся тем, что клетки бактерий Escherichia coli BL21 DE3 pClcRFP иммобилизуют в агарозные сферы с диаметром от 50 до 70 мкм, помещают их в ловушки биосенсора, осуществляют подачу анализируемой жидкой среды в биосенсор, измеряют свечение агарозных сфер с помощью флуоресцентного микроскопа с камерой или флуориметра, после чего полученные в анализируемой жидкой среде результаты обрабатывают и сравнивают с контрольными, при этом контрольными считают результаты флуоресцентного свечения агарозных сфер в ловушках до заполнения их анализируемой жидкой средой для детекции.

5. Штамм бактерий Escherichia coli BL21 DE3 pClcRFP, представляющий собой биоселективный элемент для детекции ионов меди.