Способ определения протеолитической активности ферментного препарата Советский патент 1983 года по МПК G01N33/48 

Изобретение относится к биохимииГГ в частности к способгьм определения активности ферментов.

Известен способ определения протеолитической активности, в котором в Ьидролизат белкового субстрата, полученный при рН .8,5 и 40С, добавляю трихлоруксусную кислоту и определяют количество неосаженных мелких пептидон спектрофотометрированием при помощи реактива Фолина 1}

Недостаток этого метода заключается в том, что он позволяет работать только в узком интервале оптической плотности (0,15-0,35) и дает сравнительно низкую точность определения протеолитической активности (коэффициент вариации составляет 5%) Кроме того, протеолитическая активность .по этому методу выражается в относительных единицах, а желательно определять протеолитическую активность в абсолютных единицах, указывакадих количество разорванных ферментом пептидных связей.

Наиболее близким к изобретению по технической сущности и достигаемому эффекту является способ определения протеолитической активности, включающий инкубирование раствора |фермента с субстратом, введение в инкубационную смесь буфера с рН 9,3, обработку полученного гидролизата 2,4,б-тринитробензолсульфокислотой с последующим его спектрометрировани-v ем С 2 .

Недостатком известного способа является его невысокая точность. Систематическим ошибкам и увеличению разброса результатов измерений способствуют образукяциеся в реакциисульфит-ионы. Они дают окрашенные . комплексы с тринитробензолсульфокислотой ( нм) и с продуктами 1 ( 00 Поэтому измеряют не поглощение продукта/а суммарное поглощение ряда оединений. Вследствие комплексообразования калибровочный график не является прямолинейным. При проведении прямой методом наименьших квадратов она не идет через начало координат (фиг. 1). Сульфит-ионы легко окисляются кислородом, растворенным в реакционной смеси. CKOJpocTb окисления зависит от таких случайных факторов, как содержание кислорода в пробах, интенсивность перемешивания. Это приводит к колебаниям концентрации сульфит-ионов и, тем самым, измеряемой оптической плотности.

Цель изобретения - повышение чувствительности способа.

Поставленная цель достигается .тем что согласно способу определения --: протеолитической активности ферментного препарата, включающему инкубирование пробы с субстратом, добавле ние в инкубационную смесь 2,4,6-тринитробензолсульфокислоты с последукадим спектрофотометрированием реакционной смеси, в реакционную смес перед спектрофотсчиетрированием вводят реагент, связывающий сульфитионы.

При этом в качестве реагента, связьгаающего сульфит-ионы, используют формальдегид, метилвинилкетон или акрилнитрил в концентрации 0,30,6 М. .

Сущность способа заключается в т что в качестве субстрата могут быть использованы любые белки или пептиду, расщепляемые данным протеолитическим ферментом. Предпочтительно, чтобы свободные аминогруппы субстратов были блокированы (например, как в Н|Ы-диметилказеине). В этом случае контрольныепробы имеют низкую оптическую плотность, что повышает точность определения протеолитической активности.

Для проведения определения протелитической активности исследуемый раствор фермента инкубируют с субстратом. В инкубационную смесь добавляют буфер ,3, раствор 2,4,6-тринитробензолсульфокислоты, термостатируют при С в течение 30 мин, добавляют формалин до концентрации формальдегида 0,3-0,6 М, взбалтывают и спектрофотометрируют при 420 нм.

Способ проверяют на следующих ферментных препаратах: щелочночной

протеазе из Bac.subtifis, химотрипсине, протосубтилине ГЗх.

Пример. Определение активности нейтральной протеазы в протосубтилине ГЗх.

В универсальном буфере ,2 готовят 0,75%-ный раствор белкового субстрата. Концентрация ферментного препарата в универсальном буфере ,2 0,25 мг/мл. В две пробирки нливают по 1 мл 0,75%-ного раствора субстрата, термостатируют при в течение 5 мин. В одну пробирку приливают 1 мл ферментного раствора, в другую - 1 мл инактивированно кипячением ферментного раствора (контроль) и инкубируют 10 мин при , после чего выдерживают обе пробирки в кипящей водяной бане 2 мин. В пробирки приливают по 10 мл буфера ,3 и по 1 мл 0,7%-ного раствора 2,4,6-тринитробезолсульфокислоты в дистиллированной воде, взбалтывают и выдерживают при в течение 30 мин, после чего добавляют по 1 мл 6М раствора формалина, опять взбалтывают и определяют оптическую плотность раствора на спектрофотометре при 420 нм против контрольной пробы (с инактивированным ферментом). Средняя оптическая плотность 0,368.

Калибровочный график получают тем же путем, только вместо инкубационной смеси фермента с субстратом беруф растворы глицина известной концентрации.

Протеолитическую ак тив ность (ПА) вычисляют по формуле

где Д - оптическая плотность раствора;

14 - объем реакционней смеси, ГЭ - глициновый эквивалент, определяемый по калибровочной кривой (оптическая плотность , соответствующая 1 мМ . глицеина, фиг.); М - Количество ферментного препарата, ; взятого на протеслк, мг;

1000 - переводный коэффициент полученных единиц на 1 мг фе1 вентного препарата. За единицу активности принимается такое количество фepvleнтa, которое за 1 мин при образует 1 мкмоль свободных аминогрупп.

Прим е. р 2. Определение активности щелочной прртеазы из ЕасМцв sv)± tiCis.

В универсальном буфере ,5 готовят раствор белкового субстрата концентрации 0,75%. Концентрация ферментного препарата в том же буфере ,5 равна :2,0 мг/мл. В две пробирки наливают по 1 мл раствора субстрата, термостатируют при в течение 5 мин, В одну пробирку приливают 1 мл ферментного раствора, в другую - 1 мл инактивированного кипя0чением ферментного раствора и инкубируют 10 мин-при , после чего выдерживают обе пробирки в кипящей водяной бане 2 мин. В пробирки приливают по 10 мл 0/7%-ного раствора

5 2,4,6-тринитробензолсульфокислоты, взбалтывают и выдерживают при в течение 30 мин, после чего добавляют nq 1 мл 30%-него (4,3 М) раствора метилвинилкетона,ОПЯТЬ взбалты0вают и определяют оптическую плотность при 420 нм. Средняя оптическая плотность 0,415.

Протерлйтическая активность.рас,гсчитанная; по формуле, приведенной в. примере 1, равна. 46,9 ед/г. .

В таблице представлена статистическая обработка результатов сравнения точности предлагаемого спосоQ ба с известным (на примере определения протеолитической активности прочтосубтилина ГЗх).

1. СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ П ОТЕрЛИТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ФЕРМЕНТНОГО ПРЕПАРАТА, включающий инкубирование пробы с субстратом, добавление в инкубационную смесь 2,4 ,.6-тринитробензолсульфокислоты с последующим спектрофотсметрированием реакционной смеси, отличающийся тем, что, с целью повышения чувствительности способа, в реакционную смесь перед спектрофотометрированием вводят реагент, связывающий сульфит-ионы. 2. Способ ПОП.1, отлича ю-, ц и и с я тем, что в качестве реагента, связывающего сульфит-ионы, . используют фосахальдегид, метилвинилкетон или акрилнитрил в концентра- Щ цйи 0,3-0,6 М.1л ;

Предлагаемый

1 2

1

4:

5 1 2

2

3

2,30 1,91 1,57

1г71 1,32

2,37 1,49

Известный

1 2 3

1Р 10

10 10 10 10

4 5 6

Средний коэффициент вариации v по примеру 1 равен , по примеру 2 - 1,72%, а по методике известного 25 способа - 3,5%.«Из этого следует, что точность предлагаемого способу выше примерно в 2 раза.

Таким образе, предлагаемый способ по сравнению с изйэестным noBijnraeT

Продолжение таблицы

146,01

1,80

798,21 4,24

451,33 2,72

4,69 4,68

3,84 4,38

2,11 3,18

точность определения в 2 раза, что дает возможность, в свою очередь/ повысить точность стандартизации окрашенных субстратов для определения протеолитической активности и точность измерения активности ферментных препаратов в абсолютных единицах.