Способ получения сухого материала васILLUS тнURINGIеNSIS Советский патент 1982 года по МПК A01N63/00 

(5) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СУХОГО МАТЕРИАЛА BACILLUS THJRINGIENSIS

Изобретение относится к микробиологической промышленности и может быть использовано для получения посевного материала и поддержания энтомопатогенных микроорганизмов. Известен благ оприятный субстрат для поддержания Bacillus thuringiensis, которым является растертые трупики чувствительных к этим бактериям насекомых, а именно гусениц тутового шелкопряда 1 . Известен также способ получения сухого материала и поддержания энтомопатогенных бактерий Вас. thuringien sis, заключающийся в заряжении бакте риями чувствительных к ним насекомых например гусениц сибирского шелкопряда. Погибших гусениц высушивают в эк сикаторе над хлористым кальцием при комнатной температуре в течение 10-12 суток, затем их растирают в по рошок, в результате получают сухой материал энтомопатогенных микроорганизмов. Поддержание их заключается в слудующем: из полученного сухрго материала готовят суспензию, затем 1 мл этой суспензии переносят в чашку Петри с расплавленным мясо-пептонным агаром и перемешивают, чашки с посевом инкубируют в термостате в течение гб суток. Затем из нескольких колоний, характерных для Вас. thurinfiiensis var dendrolenus,производят посев на скошенный мясопептонный агар в пробирках, инкубируют в термостате в течение Ц-6 суток, полученные культуры типируют, определяют чистоту культуры, выбраковывают.культуры, имеющие контаминанты, отбрасывают культуры других вариантов Bac.thuringiensis, после чего готовят суспензию чистой культуры, полученной суспеНзиёй заражают гусениц сибирского шелкопряда 2. Недостатком извесГного способа является то, что .насекомые всегда содержат в пищеварительном тракте и на поверхности тела разнообразные микроорганизмы - контаминанты и другие варианты Вас thuringiensi поэтому при выделении культур из сухого материала, а также при зараже нии гусениц, необходимо осуществлять посев культур и их типирование, производить очистку культур от конта нантов.Способ весьма трудоемкий и продолжительный, навыполнение его уходит 4 0-584 час. Кроме того, для осуществления известного способа необходимо использовать мясо-пептонный агар. ПрИ определении результатов этот способ несет в себе элементы .субъективности и требует высокой квалификации исполнителя. Цель изобретения - исключение из сухого материала микроорганизмов контаминантов, а также случайных вариантов Вас, thuringiensis, сокращение и упрощение числа, операций, уменьшение трудоемкости и снижение требований к опытности и квалификации исполнителя. Поставленная цель достигается тем что операцию заражения гусениц осуще ствляют с использованием стерильного корма, который стерилизуют в автокла ве, затем смешивают с суспензией энтомопатогенных микроорганизмов и кор мят насекомых-гнотобионтов или заражают их погружением на 3-5 с в суспензию. П р и м е р 1. Ампулу с лиофильно высушенной дрожжеполисахаридной сре дой с культурой Вас.thuringiensis Galleriae (серотип У)вскрывают, нали вают в нее пипеткой 1 мл стерильной воды и взбалтывают в результате полу чают суспензию-, которую вливают в стерильную ступку, куда помещают 3 г стерильного корма для гусениц Galleria mellonella, затем суспензию вместе с кормом растирают и перенося в стерильную чашку Петри, куда поме щают 15 гусениц - гнотобионтов Galleria mellonella У-У1 возрастов и выдерживают в термостате при 2830 С в течение 72 ч. Погибших гусениц переносят в стерильную колбу емкостью 50 мл с ватно-марлевой пробкой, колбу с трупами гусениц помещают в термостат и выдерживают 8 суток при 29-30°С, при этом ведут контроль спорообразования, для этого из трупов гусениц готовят мазок, фиксируют на пламени спиртовки, . окрашивают фуксином и микроскопиру94 ют. Когда около 96% клеток завершают спорообразование в колбу с трупами гусениц заливают 30 мл стирильной воды и стеклянной палочкой трупы гемогенизируют, полученный гемогенат трупов стерильной пипеткой разливают по 2 мл в стерильные ампулы емкостью 5 мл, помещают в камеру лиофилизатоМО Т и МИНУС 18° С ра, сушат при lOUl и минус в течение 60 ч, затем из ампул удаляют воздух с помощью вакуум-насоса и при Т и ампулы запаивают пламенем горелки. Контроль на присутствие контаминантов и случайных вариантов Вас.thuringiensis осуществляют следующим образом. Ампулу с лиофильновысушенным трупным материалом вскрывают, наливают в нее пипеткой 2 мл стерильной воды, содержимое суспендируют и производят посев на скошенный мясо-пептонный агар в пробирках и чашках Петри, посевы инкубируют в течение 72 ч при ,о, 32 С, затем производят сравнение выросших колоний визуально и делают из 15 колоний мазки, фиксируют над пла-. менем спиртовки, окрашивают и микроскопируют, готовят суспензию культур ° скошенного агара в пробирках и осуществляют сёроагглютинацию с сыворотками серотипов Вас. thuringiensis, в результате контаминанты в сухом материале не обнаруживают, суспензии культур со скошенного агара агглютинируют с сывороткой серотипа У и не агглютинируют с сыворотками других серотипов Вас. thuringiensis, следовательно случайные варианты Вас, thuringiensis в сухом материале отсутствуют. П р и м е р 2. Ампулу с сухим ма- . Вас thuringiensis var Galleriae, полученным в примере 1, заливают 2 мл стерильной воды, содержимое ампулы суспендируют, после чего ее выливают в дтерильную ступку, куда помещают 5 г стерильного корма, все перемешивают и растирают стерильным пестиком, инфицированный корм раскладывают в две чашки Петри, куда помещают по 15 гусениц-гнотобионтов У-У1 возрастов. Далее операцию продолжают, как в примере 1 до получения сухого материала. В результате этого эксперимента контаминанты в сухом материала не обнаруживают, суспензии культур со скошенного агара не агглютинируют с сыворотками., других серотипов Вас thuringiensis, а аглютинируют с сывороткой серотипа У.

Примерз. С агаровой куль- , туры Вас thuringiensis var Galleriae делают смыв стерильной водой, из смыва приготовляют суспензию, содержащую 32 млн, спор в 1 мл, после чего 3 мл суспензии наливают в стерильную ступку, aafeM гусениц-гнотобионтов Galleria mellonella 1У-У возрастов стерильным пинцетом на с окунают в эту суспензию и по 10-15 особей помещают в четыре стерильные чашки Петри со стерильным кормом. Чашки с содержимым термостатируют при 28-30 С в течение 72 ч. Последующие операции осуществляют как в примере 1 до получения сухого материала. После этого контаминантов и случайных вариантов Вас, thuringiensis в сухом материале не обнаруживают Формула изобретения

Способ получения сухого материала Bacillus thuringiensis.включающий приготовление суспензии бактерий, заражение насекомых и высушивание погибших насекомых, о т л и ч а ющ и и с я тем, что, с целью исключения попадания в сухой материал посторонних микроорганизмов, а также снижения трудоемкости, для заражения используют безмикробных гусениц rialleria mellonella.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

.1, Африкян Э.К, Энтомопатогенные бактерии и их значение, Изд,АН Армян ской ССР, Ереван, 1973, с. 238.

2. Талалаев Е,В. К методике сохранения вирулентности споровых бактерий, Микробиология, 1969, т. 38, 6 (прототип).