Штамм (вниигенетика энто-77) Советский патент 1977 года по МПК C12K1/00 A01N15/00 

Таблица I

выпуклый, цвет белый. Посев штрихом. При инкубации в течение 6 сут при 28-30°С на МПА штрих растет умеренно, форма штриха корневидная, поверхность матовая, гладкая, профиль плоский, штрих непросвечиваюший.

консистенция тягучая, запах слабый специфический, окраска питательной среды не изменяется.

Посев уколом. Рост по уколу в МПА корневидный по всей длине и по поверхности. В мясо-пептонном бульоне при 28-30°С в первые 3 сут мутность суспензии умеренная, в последующее время на поверхности бульона по границе со стеклом появляется слабый рост. При стоянии образуется осадок белого цвета.

На ломтиках картофеля штрих влажяый, блестяший. Пигмент на картофеле не образуется.

Таблица 2

Па мясо-пепто«ной желатине (МПЖ) растет медленнее, образует колонии белого цвета диаметром 1-2 мм, с гладким краем, матовой поверхностью и плоским профилем. Полное разжижение желатины происходит на пятые сутки. При этом на поверхности образуется матовая тонкая пленка. посеве уколом в МПЖ рядом с уколом образуются комки.

Таблица 3

Выживаемость гзсениц (%) при концентрации спор, млн/мл

Биохимические свойства.

Крахмал гидролизует. Клетчатку не усваивает. При добавлении суспензии клеток в молоко oiHo начинает свертываться через 10 ч. В момент свертывания ,75. Па моркоьи не растет.

Углеводы.

Глюкозу усваивает. Сахарозу, маннозу, галактозу, маннит, лактозу и глюкозу не сбраживает. Нитраты не использует. Желатину разжижает.

Антигенные свойства.

Выявление антигенных свойств штамма ВНИИгенетика ЭНТО-77 с использованием преципитируюших сывороток подтверждает его идентичность серютипу Y.

Антагонистические свойства не проявились по отношению к Вас. subtilis. Вас. micoides. Вас. thuringiensis var. galleriae 11-67, Вас. thuringiensis var. dendrolimus. Вас. thuringiensis var. insectum, Staphylococcus aureus, Actinomyces griseus, Candida.

Хранить штамм рекомендуется в виде лиофилвно высуш1енной культуры в стеклянных запаянных ампулах.

Лабораторный анализ показал, что на новом мутантном штамме фаг gfi практически |Не развивается как на твердой, так и на жидкой питательных средах, а фаг gs на твердой среде не образует негативных колоний. В жидкой среде развитие фага gs ограничивается по сравнению со штаммом 11-67 в .

Эффективность титрования фагов gi и gs яа твердой среде приведена в табл. 1.

Развитие фагов gi и gs в жидкой питательной среде приведено в табл. 2.

Обработка бактерий мутагенами, в частности нитрозоизанидином может привести к изменению токсических свойств штамма. Табл. 3 показывает, что токсические свойства нового штамма сравнимы со свойствами исходного 11-67.

Пример использования штамма ВНИПгенетика ЭПТО-77 для промышленного производства препарата энтобактерина.

Подготовка посевного материала.

Исходную культуру штамма выращивают в течение 6 сут в пробирках на скошенной агаризованной среде следующего состава 1: Мясной бульон, л1

Пептон, г10

NaCl, г5

Агар-агара, %2

рН среды 7,5-7,8.

Шестисуточную культуру петлей переносят с косЯКов в колбы емкостью 500 мл с дрожжеполисахаридной средой по 50 мл в каждой. Состав дрожжеполисахаридной среды может быть в двух ва-риантах (2а или ). Состав среды 2а, вес. %: Кукурузиый экстракт2-2,5

(40-50 мг%

аминного азота

в среде)

Гидролизат кормовых

18

дрожжей

Глгокозобелковый концентрат0,05 СаСЬ

от состава 2а. ВмеСостав 26 отличается сто глюкозобелкового конце-нтрата используется крахмал в количестве 2 вес. %.

Засеянные колбы подращивают на качалках при1 180-200 об/мин в течение 48 ч при 28°С до полной споруляции. После этого с помощью аппарата Боброва посевной материал из колб передается в ферментеры со средой 2а или 26.

Ферментация. Процесс выращивания .культуры в ферментерах ведут при следующих условиях:

Температура, °С28-30

Расход воздуха, л/л среды

в минуту1

Непрерывное перемешивание

при помощи мешалки Давление в ферментере,

атм0,4-0,5

рН ферментационной среды 7,5-7,8 В процессе выращивания через каждые 8 ч из ферментера отбирают пробы для микКоличество фаголизисных ферментации при использовании природных штаммов и нового штамма ЭНТО-77 в качестве продуцентов Формула изобретения ШтамМ Bacillus thuringiensis var. galleriae (ВНИИгенетика ЭНТО-77). Хранится в коллекции Всесоюзного научно-исследовательского института генетики и селекции промышленных микроорганизмов, регистрационный но мер 980. Штамм является продуцентом препарата энтобактерина, активного по отношению к гусеницам Galleriae mellonella. Морфология: Грамположительные спорообразующие палочки размером: длина 4-7 мкм, средний -

робиологического и биохимического контроля развития кз тьтуры.

Гашение пены производят путем дозированной подачи стерильного пеногасителя.

Выращивание культуры в ферментере продолжается 30-35 ч. Процесс прекращают по заключению микробиолога при условии наличия в культур а льной жидкости 20-40% свободных спор и кристаллов.

Приготовление препарата энтобактерина.

Концентрирование культуральной жидкости осуществляют на сепараторах. Сушку полу2ченной пасты производят методом распыления в потоке горячего воздуха на распылительной сушильной установке. Из высушенного просеянного продукта отбирают среднюю пробу для определения кратности разбавления. Кратность разбавления наполнителем устанавливают, исходя из определени/я наименьшей концентрации разбавленного продукта, вызывающего гибель не менее 50% испытываемых гусениц Galleriae mellonella на шестые сутки опыта. Для усреднения препарата используют наполнитель - каолин.

Использование штамма ВНИИгенетика ЭНТО-77 для производства энтобактерина позволяет осуществлять крзннотоннажное производство этого препарата, что невозможно при использовании природных штаммов- продуцентов из-за частых фаголизисов.

Свойство фагоусгойчивости нового штамма ВНИИгенетика ЭНТО-77 позволяет снизить количество фаголизисных ферментации до 3-5%. Это видно из данных заводских испытаний, представленных в табл. 4.

Таблица 4 5,5 мкм, ширина 0,5-0,6 мкм. Подвижные. Встречаются в виде цепочек. В клетках образуются споры эллиптической формы с диаметром 0,9-1,5 мкм и кристаллические включения неправильной формы. Споруляция начинается через 24-39 ч. К у л ь т у р а л ь 11 ы е и ф и 3 и о л оги ч ес к и е признак и,. На мясо-пептонном агаре (МПА) образуются мелкие круглые с четким краем колонии диаметром 2-3 мм с частотой «1 % выщепляются более крупные колонии R-формы.

Центр колонии выпуклый, цвет белый. Штрих на МПА у шестисуточной культуры корневидный, гладкий, с матовой поверхностью. Окраска питательной среды не изменяется. Запах слабый специфический. Посев уколом. Рост по уколу в МПА корневидный по всей длине и по поверхности. Оптимум роста при 28-30°С. В мясо-пептонном бульоне при 28- 30°С в первые 3 сут мутность суспензии умеренная. На поверхности бульона пОЯвляется слабый рост. При стоянии образуется осадок белого цвета. На картофеле пигмент «е образуется, штрих влажный, блестящий.

На мясо-пептонной желатине (МПЖ) растет медленнее, образует КОЛОНЕИ белого цвета диаметром 1-2 мм, с гладким краем, матовой поверхностью и плоским профилем.

Полное разжижение желатины происходит на пятые сутки, при этом иа поверхности образуется матовая тонкая пленка. При посеве

уколом в МПЖ рядом с уколом образуются комки.

Биохимические свойства.

Крахмал гидролизует. Клетчатку не усваивает.

Нитраты не использует. Молоко пептонизирует через 10 ч.

На моркови не растет. Желатину полностью разжижает.

Отношение к углеводам: глюкозу, мальтозу и галактозу усваивает, сахарозу, маннозу, галактозу, маннит, лактозу и глюкозу не сбраживает.

Антигенные свойства.

Идентичен серотипу V. Антагоннстическне свойства не обнаружены. Устойчив к фагам g и gs. В течение 30-35 ч в жидкой регламентной среде образует до 2,5-10 спор и кристаллов на 1 мл.