Способ получения 6-аминопенициллановой кислоты Советский патент 1979 года по МПК C07D499/10 C07D499/42 

(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ 6-АМИНОПЕНИЦИЛЛАНОВОЙ КИСЛОТЫ аиипазы, адсорбированной на полимере ипи сополимере метакриловой кислоты и поперечно-сшитой с помо.щью агента, образующего поперечные связи и выбранного из группы, включающей альдегид гп -таро вой киспоты, глиоксапь ипи формальдегид. Особенность предлагаемого способа - использование в качестве полимерного субстрата полимера ипи сополимера мет акриловой киспоты. При осуществлений способа желательно использовать пенициллиновую ацилазу со степенью чистоты в пределах 1530 мкмоль/мп протеина в 1 мин. В качестве субстрата можно использовать сополимер метакриловой киспоты и дивинипбензола или полимер или сополимер, содержащий бензолсульфонипьные группы. Обычно используют субстрат, имеющий макропористую форму. При этом ферментный комплекс предпочтительно использовать в виде тонко измельченных частиц размерами 2,О-О,01 мм. Процесс желательно вести при 30-5О С и рН 7,0 8,5 при непрерывном ипи периодическом

добавлении гидроокиси натрия.

Пенициллиновую ацилазу получают предпочтительно с помощью бактерий Eschetichioi Coti при применении ее для получения 6-АПК из бензилпенициляина или с помощью грибов,и актиномицетов при применении феноксиметилпенициллина в качестве исходного продукта.

Установлено, что эффективность реакции образования поперечных связей и удельная активность полученного нерастворимо го в воде энзима улучшаются при увеличении степени чистоты иЯ)Ходного энзима. Однако при чрезмерной чистоте этого энзима эффективность указанной реакции и активность полученного энзима yxyif шаются, поэтому необходим экономически выгодный предел степени очистки исходного энзима. Обычно чистота ацилазы 0,15 - 50 мкмоль/мг протеина в минут} предпочтительно 1,5-30 мкмоль/мг протеина в минуту.

Очистка энзима перед адсорбцией и сшиванием достигается при нагревании раствора энзима в течение короткого периода при температуре, равной примерно 50°С, например в течение ЗО мин с последукнцей ультрафильтрацией. Дляочист ки энзима можно также применять фракционированное осаждение или обработку ионообменными целлюлозами или Срфа- дексом. 6

бенно пригодны сополимеры под торговым .наименованием Амберлит 3RC 50 фирмы энд Гасс комп.., США, а также сополимер метакриповой кислоты, выпущенный недавно в продажу под торговым наименованием Цеокарб 227 фирмой Пермутит. Последний представляет собой сополимер дивинилбензола и метакриловой кислоты, содержащий также бензолсульфонипьные группы. Предпочтительны полимерные субстраты в виде тонко измельченных частиц или грануд, проходящих через сито с отверстиями диаметром 2,0 мм. Однако частицы получаемого комплекса не должны быть настолько мелкими, чтобы их нельзя было выделить из реакционной смеси фильтрованием или применить в колонном реакторе. Частицы полимера должны быть размерами больше О,О1 мм. Выбор размеров частиц зависит от применяемой системы реакторов.

Для контактирования с полимером пенициллиновую ацилазу деализируют в вогь ном растворе до уменьшения ионной проводимости от обычной величины 5-Юммо до 0,1-4 ммо, предпочтительно до 1 ммо, рН раствора энзима 4,5-7,0. Для достижения максимальной адсорбции и активности энзима эмпирически подбирают и устанавливают величину рН в указанных пределах. Обычно оптимальная величина рН 5,2-6,5. Для обеспечения максималь04Подходящим субстратом является полимер ипи сополимер метакриповой кислоты. Такие попимеры или сополимеры могут содержать свободные карбоксияь- ные группы, которые сообщают полимеру кислотную функцию. Макропористые полимеры и сополимеры метакриповой киспоты более предпочтительны, чем геле- образные полимеры и сополимеры этой кислоты. Пригодны полимеры метакриловой кис- оты, не растворимые в воде и потому обычно в виде поперечно-сшитых сополимеров, например сополимеров метакриловой кислоты и дивинилбензола, или диэфиров гликоля и метакриловой кислоты, например диэфира этиленгликоля и мет. акриловой кислоты. Для приготовления сополимеров можно использовать и {фугие мономеры, например эфиры метакриловой киспоты. Одним из преимуществ данного изобретения является возможность применения полимерных субстратов в виде продуктов, используемых в промьпиленности для других целей, например катионообменных смол слабо кислотного типа, Осо- ной адсорбции энзима полимер обрабатывают раствором энзима в течение 2-16 После адсорбции на субстрате энзим обрабатьгеают агентом, образующим поперечные связи, в виде альдегида гпутаровой кислоты, глиоксаля. или формальдегид Предпочтительно применять альдегид или глиоксаль. При применении альдегида глу таровой кислоты получается энзим, обладающий наилучшими свойствами при приГОТОВ7ЮНИИ 6-АПК. Агенты, образукяцие попер ечные связи, обычно применяют в водном растворе при концентрации 0,1- 15 вес.% предпочтительно 0,5-5,0 вес.% По окончании реакции образования попе речных связей желательно удалить или сделать неактивным агент, образующий сетчатую структуру. Избыток его можно удалить при промывке водой илк раствором амина; очень эффективна в этом отношении мочевина. Перед применением энзимного комяпекса для получения необходимо тщательно довести его рН йо величины, необходимой для этого процесса, что достигается обычно при добавлении щеиочк в конце реакции образования поперечных связей. Эта величина лежит в пределах 6,О-9,О, но обычно 7,,5 вяи предпочтительно равна 7,8. Пра таком прй менении комплекс контактируют с водным раствором бензилпеницйлпина ияй фенокси метилпенициплина йгга их сопью яра определенной величине рН. Температуру реакции обычно поддерживают в.нрёцепах ЗО-5ОС,предпочтитепьно 37С. Во время реакции из бензилпеиициллина выце ляется фенилуксусная кислота, а из фенок симетилпенициплина феноксиуксусная киолота. Эти кислоты непрер гено или периодически нейтрализуют дия поддержания определенного передела рН реакционной смеси. Выбор необходимой для нейтрализации щелочи не имет решающего значения. Обычно применяют раствор гидроокиси натрия-, хотя при желании можно применять такое летучееоснование, как аммиак ИГО триэтипамин. Водорастворимые энзимные компгюксы обычно настолько стабильны механически и биологически, что их можно применять по крайней мере для 40 поспедоватепьных расщеплений пенициллина, проводимых в реакторе периодического действия. При осуществлении приведенных в примерах опытов применяют частично очищенный энзим, выдепеиньй механически в гомоге низаторе из клеток вырабатывающего auiiлазу штамма EscherJchia Coti MCIB 8734. Остатки клеточной ткани удаляют фигаьт рованием после установления рН 5,0 и раствор энзима очищают до достижения: необходимой удельной активности, т. е. 1,5-ЗО мкмолей/мг протеина в I мин. Затем раствор энзима диализуют до доотижения проводимости, равной примерно 1 ммо. Пример 1. Аликвотные количества (2О-25 г или 5О г) указанных катионных и анионных ионообменных смоп суспендируют в шютиллированной воде (примерно 10О-5ОО мп) н устанавиивают рН в пределах ,3 в случае катионных смол и 6, в случае анионных смоя, добавляют гидроокись яатркя или соляную кислоту при энергичном пере-мешивании. Затем смолы OTpensnor фильтрованием, тщатепьио промывают дистнл- пированной водой, суспеннйрукэт в растворе частично очищенной пеницилпиновой ацияааы 6О-1ОО, 25О ияи 5ОО мл; удельная активность 3,85-6,75 кмопъ/мг протеина s i мйН| проводимость менее 1 ммо) и устанавниваюг требуе {ук вели- чЕцу рН, Количество энзима, адсс б1фованного смолой в пределах ьжмоль смолы в 1 мин. Адсорбщся происходят при легком перемешивая51и в течение примерно 16 ч и при подаержани я рН добавгюнкем тнтрованного раствс а. Затем смолу отделяют фильтрованием, вновь суспендируют в водном растворе апьдегнда глу- TapoBOHKHcaoiM (10Омл;О,825-3,3 вес.% по объему) и проводят реакцию в течение примерно 16 ч. Полученные комплексы энзим-смопа выдепяют,.триждьт промывают пистйпяированной водой, снова суспендируют в воде ИЛИ 0,2 М фосфатном буфере с рК 7,8.Доводят рН до 7,8, обрабатывают в течение 1 ч водным раствором мочевины (10О ыщ 0,1 М; рН 7,8) и, наконец, промывают трижды дистиллированной водой. Каждый из попученпых энзимных комплексов применяют дпя получения 6-АПК из бензиппенициппина в стандартных условиях при рН 7,8 и температуре . Активности этих комплексов указаны таб. 1. Активности относятся к комплексам, прнготовпенным при рН, оптимальом для адсорбции энзима и сохранения его активности. Смопы Бйо-Рекс и Чепекс - продукты ирмы Био-Рад Лабораторис ов Калифорния, США, смолы Леватит - ьродукты

76541706

фирмыБайер А.Г., ФРГ cMonbiLleoKafi6 ии смопы Амберпит - ироцукты фирмы Ром

Церолит - продукты фирмы ПермутиткомпУ зенд Гаас, Фипадепьфия, США.

.Таблица

Продолжение табп. 1

Прим

Примеры 2-5. В этих примерах показано влияние разной степени чистйты пенициппиновых энзимов на стадии адсорбции. Опыты провод5гг аналогично примеру 1. Энзимы абсорбируют прирН 5,7 и комплекс энзим-смола обрабатывают 3,3вес.% (по объему) раствором альдегида гпутаровой :киспоты. Применяют смолу Амберпит 1R.C5,0, которую промывают щелочью, а за- тем кислотой.

Полученные удельные активности комп.лексов приведены в табл. 2. Эти результаты показывают, что прн увеличении сте пени чистоты исходного энзима в определенных пределах увеличивается удельная активность комплекса.

Таблица 2 ечания:Д- результаты очень разные; указанные величины - средние нескольких определений; - строение полимера неизвестно; f- смолы нет в продаже; - размеры частиц О,О74-0,149 мм; смолы А-Б сильно анионные, Г-Е слабо анионные. Ж-М сильна катионные, П-Ц слабо катионные. Примеры 6-15. В этих примерах пЪказано значение величины рН, при которой энзим адсорбируется на смопе. А. Устанавливают рН пяти аликвотны количеств смолы Амберлит 84,9j 5,1 5,3 5,5 и.5,7. Смолу высушивают и каждый образец добавляют к створу частично очищенной пеницилпи .новой ацилазы (активность 6О,9 мкмоль /мл в 1 мин, 95 мл; 16,8 мкмоль/м71 протеина в 1 мин; проводимость О,55м конечный объем раствора 2ОО мл). Пос ле адсорбции при подходящей величине рН в течение 16 ч комплекс обрабатьь . вают внаногично примеру 1. Б. Еще пять аликвотных количеств той же смолы обрабатьгаают таким же способом, но адсфбци;я, проходит при рН 5,7-6,5. Испопьэованный энзим имеет следутаие характеристики: 105 мл, акти ность 54,7 fкмoль/мл в 1 мин; ;9,ОЗ мкмопь/мп протеина в 1 кдан; про водимость 0,75 ммо). Реаупьтаты экспериментов приведены табл. 3. Иа тв6п{шы йидно, чтооптималь;ная для ацсорбцив вепвчина рН 5,2-5,8 Таблица 3. Примеры 16 17. Эти примеры показывают влияние частиц смолы разны размеров. Применяют смолу Амберлит хроматографического сорта, т. е. смолу Амберлит CG-5O типа 1 с частицами, проходящими через сито с отверстиями диаметром 0,149 мм,но за держиваемыми на сите с отверстиями диаметром 0,074 мм. Аликвотные количества (15 г) смолы адсорбируют энзим (200 мл; 23, мкмоль/ /мл в 1 мин; 3,86 мкмоль/мг протеина в 1 мин) при рН 6,3 в течение 3 ч. Полученные комплексы отделяют и промывают аналогично примеру 1. Активность продукта (21 г) равна 114,5 мкмоль/г в минуту (сухой вес), При сравнении этого продукта с продуктом полученным в цримере 2 при применении Амберлита JRC-50 с частицами, размеры диаметров которых 0,297-1,41 мм, установлено, что лучшие результаты достигаются при применении смолы с меньшими размерами частиц.. Этот эксперимент повторяют ..с применением смолы Амберлит фармацевтического сорта, т. е. Амберлит ШР-64 с частицами диаметром 0,037-0,149 мм. Смола адсорбирует энзим (3920 мкмоль/г в 1 мин) при рН 6,3. Энзимный комплекс реагирует с алшегидом глутаровой кислоты (3,3 вес.%, по объему). Затем его обрабатывают аналогично примеру 1. Полученный комплекс энзим/смола имеет удельную активность, равную 478,4 мкмоль/г , в 1 мин при сухом весе. Пример 18. Устанавливают рН 5,5 смолы АмберпитЗНС-50 промывкой О,2М фосфатным буфером с такой величиной или при суспендировании ее в дистиллированной, вода с добавлением раствора гищзоокиси натрия. Затем смолу дополнительно промывают дистиллированной водой по посто$шной проводимости воды. Сырую воду (1ОО г) добавл5пот к пеницилииновой ацилазе с активностью 5,25 мкмоль/мг протеина в 1 мин в 5ОО мл О,О2 М фосфатного буфера при рН 5,5 и перемешивают 2О -ч при комнатной температуре. Отделенное фильтрованием твердое вещество снова суспендируют в 50О мл 0,25%-ного (по весу на объем) расг-., вора альдегида глутаровой кислоты в фосфатном растворе и дополнительно перемешивают 20 ч при комнатной температуре. Полученный комплекс отделяют фильтрованием и промьгеают О,2 М раствором фосфатного буфера при рН 7,8 до установления этой величины рН во всей массе смолы.. Полученный комплекс смола-энзим 15 г) используют для реакции с 200мл 6,25%-ного водного раствора бензилпеницшшина в 0,О2М растворе фосфатного буфера при рН 7,8 в течение 2 ч при 13 37°С. Установпено, что этот комплекс можно легко отделять для использования еще 25 раз, так как он механически и биологически прочен. Пример 19. В этом примере пок зана возможность применения энзимного комплекса для произопдства 6-АПК в большом масштабе при многократном использовании в этих условиях. Комплекс приготовляют из смолы Амберлит 3 ЕС-5О. Активность смолы 26,3 мкмоль/г в 1 минуту. В качестве исходного продукта используют 4О л 6,5%-.ного раствора бензилпениыидлина в 0,02 М фосфатном буфере. Комплекс удерживают в реакционном сосуде с помощью проволочной сетки. По окончании реакции раствор полученной 6-АПК профильтровывают, комплекс промьтают водой и используют для следующей реакции. Средняя эффективность конверсии до 6-АПК при 50 последовательных реак циях в течение 6 ч равна 95%. При мер 2 О. В этом примере сра нивается механическая стабильность энзи ного комплекса, предусмотренного данным изобретением и приготовленного согласно примеру 1 из смолы Амберлит TRC-5O, и комплекса, приготовленного тем же способом, но из полимерного субстрата с нейтральной активностью, а именно из смолы ХАБ -7, т. е. поперечно-сшитого акрилатного эфира фирмы Ром энд Гаас США. Образцы каждого комплекса (1,6 г) суспендируют в 8л О,2 М фосфатного буфера при рН 7,8 и 37°С,и затем каждую суспензию перемешивают 72 ч при 2ОО об/мин в бродильном чане с перегородками. Пробы отбирают через каждые 4 ч и визуально наблюдают разрушение частиц смолы. Разрушений частиц XAD 7 значительно большеj чем частиц 3RC-60. Проба последней смолы, отобранная через 64, ч показьгоает большую механическую прочность смопьтЗКС. -50. Пример21. Амберпит DRD 5О (235 г; 39,4 мкмоль/г в 1 мин) приготовляют аналогично примеру 1 и используют для реакции с 6,25%-ным раствором натриевой сопи бензилпенициплина при 10 последовательных экспериментах. Каждый эксперимент проводят, применяя 1 л раствора бензилпенициллина при реак ции в течение 2 ч ЗО мин при .37С и рН 7,8. По окончании каждой реакции смолу отфильтровьтают и промьгоают дистиллированной водой. Фильтрат и промыв170ную воду концентрируют во вращающемся BaKyyivf-испарятела. Концентрат смещивают с равным объемом метилизобутипкетона, охлаждают до и подкисляют дпя осаждения 6-аминопенициплановой кислоты. Эту кислоту промьгеают небольшим количеством аистиллированной воды, ополаскивают .ацетоном и сушат. Средний выход 6-аминопенициплановой кислоты в 10 экспериментах равен 91,3%. Пример 22. Адсорбция ацилазного энзима на полиэтилене, покрытом мочевиной. Частицы поггаэтипена низкой плотнооти (примерно 400 мкмоль покрьтают полимером уретана (Уретан 641W фирмы Трей Валли Продактс Лимитед) исушат в течение 10 дней. Этот продукт промь вают в течение 1 ч 2О%-ным по объему ВОЩ1ЫМ ацетоном, затем тщательно днотиплированной водой и аликвотные коли1чества (5 г) используют дпя адсорбции энзима (125 мл; 54,0 мкмоль/мл а 1 мин;. 3,8О мкмоль/мг протеина в 1 мин) g течение 5 ч при рН 4,8-9,0. Покрытые уретаном частицы отфильтроьтают, обрабатывают в течение 3 ч аствором альдегида глутаровой кислоты (75 мл;3,3 вес.%, по обьему) и доводят х рН до 7,8 аналогично примеру 1, Несмотря на то, что покрытые уретаом частицы меньших размеров, чем чаойцыЗЙО-5О, достигщтая удегаьная акивности в 2-3 piaaa меньше активности, олученной пра применении3R.C-5О. Результаты приведены в табл. 4. П p и M e p 23. Адсорбция ацилааы на найлоне. Оргопак (порошкообразный найпон 6,, диаметр частиц 30 мкмогсь,фирма Ато Шимм Лимитеи (Вепикобритания),промьгвают в течение 1 ч раствором муравьиной кислоты, а затем тшатепьно дистиллированной водой. Атшквотные кол чества продукта (Ю г) используют для адсорбирования энзима (100 ищ 50,9 мкмоль/мл в 1 мин; 4,7 мкмоль/м протеина в 1 мин в течение 16 ч прирН 4,8-9,0. Порошкообразный найлон отфипьтровьгеают, обрабатьгвают ашздегидом гпутаровой кислоты (100 мп; 3,3%-ный раствор) в течение 3 Ч|Выделяют и пром вают аналогично примеру 1. Достигают высшую активность, равную 41,7 мкмол в 1 мин при рН 4,8 и сопоставимую с обычно достигаемой-при применении IRCОднако с учетом разницы размеров частиц найлона и ORC -50 последняя смола дает лучшие результаты. Так, например IRP-64 (фармацевтический сорт 1RC 5О; размеры частиц О,О37-0,149 мм) ;можно сочетать с ацилазой ЯПЯ получения препаратов с удельной активностью 478 мкмопь/г в 1 мин в сыром весе, т. е. более чем в одиннадцать раз превышающей активность найлоновых препаратов. Результаты приведены в табл. 5. Т.. а б л и ц а 5 Формула изобретения 1.Способ получения 6-аминопенЙциплановой кислоты путем обработки водного раствора бензилпенициппина или феноксиметиппенициллина или их соли при РН 6,О-9,0 нерастворимым в воде ферментным комплексом, состоящим из пенициллиновой ацилазы, адсорбированной на нераСтворицбм в воде полимерном субстрате, и поперечно-сшитой с помощью агенту,, образующего поперечные связи и выбранного из группы, включакщей альдегид глутаровой кислоты, гпиоксапь или формальдегид, отличающийся тем,. что, с цепью упрощения процесса и улучшения качества продукта, в качестве попимерного субстрата . используют полимер или сополимер метакриловой кислоты. 2.Способ по п. 1, о т л и ч а ю- щ и и с я тем, что используют пенициллиновую аципазу со степенью чистоты в пределах 15-ЗО мкмоль/мг протеина в минуту. 3.Способ по ПП.1 и 2, отличающийся тем, что используют субстрат Jимеющий макропористую форму. 4.Способ по пп. 1, 2 или 3, о тличающийся тем, что в качестве субстрата используют сополимер метакриловой кислоть и дивинилбензола. 5.Способ по п, 4, о т л и ч а ющ и и с я тем, что указанный полимер и/га сополимер содержит бензоасульфонильные группы. 6.Способ по пп. 1-5, отличающийся тем, что ферментный комплекс применяют в виде тонко измельченных частиц размерами 2,0-0,01 мм. 7.Способ по пп. 1-6, отличающийся тем, что процесс ведут при ЗО- 7,0-8,5 при непрерывном или периодическом добавлении гидроокиси нат -РИЯ. Источники информации, принятые во внимание при экспертизе 1. Выложенная заявка ФРГ №2143062, кл. С 12 D 13/10, О2 03 02.03.72.