Способ получения смеси ламинарибиозы и ламинаритриозы Советский патент 1982 года по МПК C07H3/06 A61K49/00 

Изобретение относится к усовершенствованному способу получения олигосахаридов из ламинарииа - смеси ламинарибиозы и ламинаритриозы, которая находит широкое применение в биоорганической химии, в иммунохимии, Извест способ получения смеси ламинарибиозы и ламинаритрозы путем гидролиза ламинарина концентрации 8,5 мг/мл в сильнокислой среде при нагревании реакционной смеси на кипящей водяной бане, полученный гидролизат нейтрализуют смолой Anberlite IR-l В(ОН) и очистку целевого продукта осуществляют на колонке со смесью угля и целита. Выход смеси ламинарибиозы и ламинаритриозы состав ляет 11,6, продолжительность процесса 360 ч 1. Недостатками известного способа получения смеси ламинарибиозы и ламинаритриозы являются низкий выход целе вого продукта и длительность проведения процесса. Целью изобретения является увеличение выхода целевого продукта и упрощение процесса. Цель достигается тем, что согласно способу получения смеси ламинарибиозы ламинаритриозы, гидролизуют ламинарин в концентрации 3,0-,0 мг/мл эндо-|Ь-1,3- глюконазой, полученной из кристаллического стебелька моллюска Chlamys abbldus, в среде ацетатного буфера, содержащего 0,04-0,1 М хлористого натрия, рН 5,3-5,5, при температуре 22-25С с последу ои1ей обработкой инкубацион ной смеси глюкозооксидазой и очистку целевого продукта осуществляют на ионообменных смолах КУ-2( и А-17(ОН). , Выход целевого продукта 60%, продолжительность процесса 9б ч. Важную роль npi| осуществлении ферментолиза играют условия проведения ферментативной реак1(ии,такие

как температура, рИ среды, ионная сила раствора, концентрация субстрата. Изменение условий процесса может вызвать изменение не только в соотношении конечных продуктов, но даже в их характере.

Так, при увеличении концентрации ламинарина выше «,0 мг/мл над реакцией гидролиза начийают преобладать .реакции трансгликозилирования, при эТом получается сложный набор олигосахаридов. Не рекомендуется брать концентрацию ламинарина ниже 3 мг/мл так как это приводит к повышенному расходу фермента, увеличению объемов инкубационных смесей и т.д., что значительно усложняет процесс.

. Выбраны оптимальныевеличины Температуры, рН среды, ионной силы раствора , при которых фермент энда-Ь-1,3-глюконаза наиболее стабилен и реакции гидролиза ламинарина протекают до конца с образованием необходимых олигосахаридов. Так как эндо-йг1,3-глюконаза лабильный фермент, то предложено добавлять к ацетатному буферу О,04М-0,1М раствор хлористого натрия. Определенная ионная сила необходима как для протекания ферментативной реакции, так и для увеличения стабильности фермента. В табл.1 представлены данные по определению оптимальной для действия эндо-(Ь-1,3-глюконазы концентрации хлористого натрия. .

Т а б л и -ц а 1

Из табл.1 видно, что фермент наиболее активен в растворе, содержащем 0,04М-0,1М NaCI.

Ферментолиз ламинарина осуществляют при рИ 5,3-5,5, так как в этом интервале рН фермент эндо-(Ь-1,3 глюконаза наиболее стабилен. Температуру Время, мин Активность фермента (метод

ферментативной реакции поддерживают равнбй 22-25°С. Повышение температуры приводит к денатурации фермента, понижение температуры уменьшает скорость реакции.

В показана зависимость стабильности фермента от температуры.

. Таблица 2 температуре, Нельсона )

Все эти подобранные условия ферментативного гидролиза ламинарина эндо-|Ь-1,3-глюконаэой из кристаллического стебелька моллюска Chlamys abbidus позволят провести ферментоВремя реакции t, ч II р И м е р 1. Ферментативный ги ролиз . л ламинаринарастворяют в 900 мл ацетатного буфера (0,05 М; рН ЗЛ) с добавкой MaCl 0,05 М . Затем в раствор ламинарина добавляю 75 мл эндог|Ь-1,3-глюконазы из Chlamys abbldus (И 1 мг)/100 мл), инкубируют смесь в течение 2 ч при . После этого добавляют еще 25 мл фермента и инкубируют смесь 2k ч. Продукты ферментолиза анализи руют с помощью жидкостного хроматог рафа. После окончания ферментативно го гидролиза инкубационную смесь, уп ривают на роторном испарителе при 50 -7U®C до 180 мл, добавляют 20 мл 3 М фосфатного буфера (рН 7,-0) и растворяют в полученном растворе, 200 мг глюкозооксидазы; смесь инку;бируют в течение 2 ч После инкулиз до конца и получить нужный набор 2в олигосахаридов. В этих условиях

i реакция гидролиза ламинарина практически заканчивается через kB ч, что показано в таСп-З.

Таблица 3

Глубина гидролиза oLj% бации с глюкозооксидазой раствор обрабатывают поочередно смолами КУ-2 (Н и (ОН ) до тех nop,nciica|:реда не станет нейтральной. Смолы промывают, промывные воды объединярт с раствором, содержащим ламинари озу и ламинаритриозу, и раствор высуншвают лиофильно. Получают аморфный пороиюк желтоватого цвета. Выход стси ламинарибиоэы и ламинарйтриозы составляет 2,k г (60% от исходного количества ламинарина). Выходы составляют для ламинарибиозы 30% и ламинаритриозы - 30% от исходнЬго количества ламинарина. П р и м е р 2. При проведении реакции с 3 нг/мл ламинарина в ацетатном буфере рН 5,3-5,5,в п0исутствии 0,1М. NaCI и при прочих указанных условиях получаются те же п(одукты реакции и .выход их не ухудшается.

7929б4б - .8

Формула изобретения ацетатного буфера, содержащего 0,ОЦСпособ получения смеси ламинарибио- 0,1Н хлористого натрия, рП 5,3-5,5, зы и ламинаритриозы путем гидролиза при 22-25°С с последующей обработламинарина и очистки смеси, о т л й- кой инкубационной смеси глюкозоокч а ю щ и и с я тем, что, с целью 5 сидазой и очистку целевого продукта увеличения выхода целевого продукта осуществляют на ионообменных смолах, и упрощения процесса, ламинарии вИсточники информации,

концентрации 3,0 - ,0 мг/мл гидро- принятые во внимание при экспертизе лизуют эндо- Ь 1,3-глюконазой, полу- 1, Методы химии углеводов. Под ченной из кристаллического стебель- Ю .ред. чл. корр. АИ СССР Кочеткова Н.К. ка моллюска Chamys abbidus, в среде Мо, Мир, 19б7, с. (прототип)