Способ определения величины синтеза ДНК в лейкоцитах периферической крови Советский патент 1992 года по МПК G01N33/60 

Изобретение относится к медицине и биологии и может быть использовано для оценки синтеза ДНК при воздействии лекарственных средств.

Цель изобретения - повышение точности способа.

Способ осуществляется следующим образом.

20 мкл цельной крови, взятой из пальца микропипеткой,гепаринизированной раствором гепарина в растворе Хэнкса (100 Е/мл), переносят в конические пробирки, добавляют Н3-тимидин в растворе Хэнкса в объеме 2 мкл до конечной концентрации .10 мкКи/мл, после чего к первым образцам сразу добавляют 6 мкл 2%-ного раствора сапонина в растворе Хэнкса, а к вторым образцам сапонин добавляют после двухчасовой инкубации при 37°С. Вызванный сапонином гемолиз развивается в течение нескольких секунд, после чего к гемолизату добавляют 500 мкл холодного раствора, содержащего 0,1 М ЭДТА; 0,15 М NaCI, 1%- ный пирофосфат натрия. Ядерный материал

осаждают центрифугированием при 10000 g в течение 5 мин. Осадок суспендируют в 100 мкл 1 н. NaCI. Солюбизированный хроматин прогревают в течение 15 мин на кипящей водяной бане для депротеинизации ДНК. Денатурировавший белок осаждают центрифугированием в течение 5 мин при 10000 д. Псоле этого к супернатанту добавляют 50 мкл холодного 30%-ного раствора ТХУ и оставляют на 30 мин при 0°С для выпадения осадка, содержащего нуклеиновые кислоты, который собирают на стеклянные фильтры фирмы Ватман GF/C. Осадок на фильтрах три раза промывают2%-ным НСЮ4, порциями по 2 мл, 96%-ным этанолом, подсушивают и переносят в 100 мкл 0,5 H.NaOH для гидролиза РНК в течение 1-12 ч без заметной разницы. Гидролизат отбирают под вакуумом, добавляют к нему 100 мкл холодного 30%-ного раствора ТХУ и осадок, содержащий ДНК, собирают и промывают на фильтрах, как описано выше. Подсушенные фильтры просчитывают в 5 мл толуолового сцинтиллятора. Величину синтеза

&

Ё

VI

СО

го ю

определяют как разницу между первым показателем включениям -тимидина в ДНК и вторым показателем.

Формула изобретения Способ определения величины синтеза ДНК в лейкоцитах периферической крови путем введения образца крови в инкубационную среду, добавления Н3-тимидина, проведения щелочного гидролиза хроматина и

определения радиоактивности в кислотно- нерастворимом осадке, отличающий- с я тем, что, с целью повышения точности способа, исследуют два образца крови, которые инкубируют не менее 2 ч при 37°С, причем в первый образец Н -тимидин добавляют до инкубации, во второй - после инкубации, а величину синтеза определяют как разницу между первым и вторым показателем включения Н3-тимидина в ДНК.

Изобретение относится к медицине и биологии и может быть использовано в клинической биологии при определении влияния лекарственных средств на синтез ДНК. Цель изобретения - повышение точности - достигается за счет определения включения Н3-тимидина в двух образцах, в первом Н3- тимидин добавляют до инкубации, а во второй - после инкубации.