Способ обработки первичнотрипсинизированных криоконсервированных клеток и кусочков органов для получения первичных клеточных культур Советский патент 1982 года по МПК C12N5/00 

I. .. . Изобретение относится к ветеринарии и биологии, а именно к применению куль тур тканей и клеток для работы с вирусами. Известен способ обработки первичнофипсинизированных клеток почек животных и человека, включающий дезагарега« цию кусочков органа растворами трипсина, эквилибрацию в защитной среде, замораживание в жидком азоте, дефростаци и последующее культивирование в виде монослоя f1 . Наиболее близким к предлагаемок изобретению является способ консервирования кусочков кожи для получения клеточных кулыур, включающий эквили&рацию биопсированного материала в криозашитной среде, содержащей диметилсульфоксид, замораживание их непосредственно в газовой фазе жидкого азота, хранение при -196 С, последующее размораживание при , механическое измельчение кусочков, культивирование в питательной среде и получение монослоя f 2 . Недостатком известного способа является то, что он расчитан на получение монослоя клеток высокоустойчивой к замораживанию ткани, какой является кожа. Он предусматривает рост монослоя клеток из кусочков органа, т.е. использование метода (фганных кулыур, который требует особых условий культивирования н имеет ограниченное применение в практике получения монослоя культур клеток. Цель изобретения - увеличение жизнеспособности клеток и ускорение сроков формирования монослоя. Цель изобретения достигается тем, что проводят суспензионное культивирование, при обрабопсе кусочков органов после из дефростации в обогащенной питательной среде, содержащей 5-30% сыворотки крови и 5-3 О% сахарозы, в течение 1-2О ч, а при обработке первичнотрипсинизированных клеток до эк39вилибрации материапа в криозащитной среде в обогащенной питательной среде, содержащей 5-3 О% сьюоротки крови, в течение 1-12 ч. П р и м е р . Из коркового слоя почек плода коровы вырезают фрагменты размером 1-2 мм и отмывают от крови в растворе Хенкса с антибиотиками (пенициллин, стрептомицин). Эквипибрирование проводят в криозащитной среде, содержащей 25% диметилсульфоксида, в течение 1 ч при . Затем кусочки органа помещают в полиэтиленовые ампулы или пакеты из алюминиевой фолн-, ги и подвергают замораживанию путем погружения в спиртовую ванну при -25 С на 30 мнн и последующего перемещения в жидкий азот. После хранения в жшшом азоте емс кусочками размораживают на кости с кусочками размораживают на водяной бане при 40°С. Для частичного удаления криопротектора 4 агменты поче промывают в растворе Кребса-- Хенсеглайта (пропись С) с добавлением 20% сахарозы. После этого кусочки органа переносят в обогащенную питательную среду, в состав которой входит смесь равных частей сред Игла; 199; 0,5% гидролизата лактальбукгина в растворе Хенкса, 15% сахарозы и 15% сьшоротки крови крупоного рогатого скота, и культивируют 4-5 ч в суспензионном состоянии при постоянном механическом перемешивании взвеси с помощью магнитной мешалки. Обработанные таким образом фрагмен ты органа подвергают последующей трип синизации 0,15-О,2% раствором фермен. та. Полученные клетки высевают в куяьтуральные емкости с питательной средой для получения монослоя. Учет жизнесП1 собных клеток после замс аживания и трипеинизации проводят с помощью мето да суправительного окрашивания 0,25%ным раствором трипановой сини с после- 3 дующим подсчетом их количества в камере Горяева. Интенсивность заполнения монослоя определяют путем измерения площади роста клеток. Данный способ обеспечивает сохранение жизнеспособности 2О% клеток и формирование сплошного монослоя на 1213-й день, т.е. как минимум, на 3-4 дня раныле, чем без предварительного суспензионного культивирования. Формула изобретения Способ обработки первичнотрипсинизированных криокшсервированных клеток и кусочков органов для получения первичньсс клеточных культур, включающий эквШ1Ибрапию материала в криозащитной среде, замораживание, дефростацию, выращивание в питателыюй среде и получение монослоя, отличающийся тем, что, с целью увеличения жизнеспособности клеток и ускорения сроков форМ1фрвания монослоя, проводят суспензионное культивирование прн обработке кусочков органов после их аефростацкк в обогащенной питателыюй среде, содержащей 5-30% сыворотки крови и 5-3 CW& сахарозы, В течение 1-2О ч, а при обработке первичнотрипсинизированных клеток до эквилибрации материала в-криозащитной среде, в обогащенной Питательной среде, содержащей 5-ЗО% сьюоротки крови, в течение 1-12 ч. Источники инфор(9ации, принятые во внимание при экспертизе 1. Зуев В. В. Актуальные вопросы ветеринарной вирусологии. Тезисы докладов Всесоюзной ветеринарной вирусологичеежой конференции 17-19 ноября 1976. Владимир, 1976, ч. 1, с. 83-85. 2.Tcweor И е4;.ае.а.аи Vitro № 5, у. 14, 1978, р. 476-478.