Способ получения 11 @ -оксистероидов Советский патент 1982 года по МПК C07J5/00 A61K31/573 

(5) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ 1Ш-ОКСИСТЕРОИДОВ

Изобретение относится к усовершенствованному способу получения 11 (Ь -оксистероидов общей формулы СНгОН -ОН :-- простая или двойная связ X - водород, метил; V - метилен, этилен, являющихся ценными лекарственными веществами. Известен способ получения роксилированных 17 oL-гидроксистерои дов прегнанового ряда путем ферментативного гидроксилирования предварительно этерифицированных в положении П-дезоксистероидов пре-гнанового ряда, после чего полученные П( -гидрокси-17(1-ацилоксистеро иды омыляют l. Недостатками способа является многостадийность и необходимость проведения гидролиза 1 1/Ь -гидpoкcи-17dL-aцилoкcиcтepoидoв, при котором образуется большое количество побочных продуктов, с чем связана необходимость дорогостоящей очистки конечных продуктов. Цепь изобретения - упрощение процесса. Поставленная цель достигается тем, что в способе получения 11/Ь-оксистероидов общей формугы (1 ) путем ферментативного гидроксилирования 11-дезоксистероидов с помощью культуры species Curvularia Lunata ферментативному гидроксилированию подвергают 11-дезоксистероид общей формулы о9 .,-0

где , X иЛГ имеют указанные значения;

R - д алкил) алкил,

с последующим выделением целевых продуктов.

Предлагаемый способ обеспечивает проведение процесса в одну стадию, вместо трех по известному способу, что упрощает процесс. Кроме того, способ обеспечивает возможность получения 11-ГИДРОКСИ-Д1 ,-стероидов общей формулы (1 ) с высоким выходом.

Следует также отметить, что для осуществления предлагаемого способа необязательно в качестве исходных соединений применять чистые продукты 1 1-дезоксистероиды общей формулы (П если их, например, полумают как сырой продукт по следующему методу.

Из раствора 1 г ( ммоль ) тозилата пиридиния и 10 г (28 ммоль) 17c 21-дигидроксистероида в 80 мл диметилформамида и 700 мл бензола для удаления следов воды при температуре бани IIO-IBO C {глицериновая баня) отгоняют 300 мл бензола при применении водоотделителя. Затем в течение непродолжительного времени охлаждают, добавляют 2Ц мл (110-1 0 ммоль) триалкилового эфира ортокарбоновой кислоты и 1 ,5 ч отгоняют остаточный бензол. После добавления 5,2 г пиридина реакционный продукт в высоком вакууме концентрируют далее до сухого остатка.

Реакция протекает количественно. Остающийся после концентрирования 17 оС, 21-(1-алкокси-алкилидендиокси)-стероид имеет сначала масляную консистенцию, однако чаще быстро кристаллизуется. Степень чистоты для последующего микробиологического гидроксилирования является совершенно достаточной, если прилипшие к кристаллизату остатки применяемых реактивов не мешают ферментативному катализу. Аналогично получают D-roмостероиды общей формулы (П).

Пример. а.Вг тозилата пиридиния и 80 г 17, 21-дигидрокси- -прегнен-3,20-диона в 5бО мл диметилформамида растворяют и разбавляют с л бензола. После этого отгоняют 1 ,5 л бензола при температуре бани 120с через водоотделитель. В горячий реакционный раствор медленно приливают 192 мл триэтилового эфира орто-уксусной кисЛОТЫ и затем 1 ч отгоняют бензол и другие легколетучие реакционные компоненты, добавляют 96 мл пиридина и при температуре бани в глубоком вакууме сгущают полностью до сухого остатка в течение 2 ч. Получающийся сначала масляный остаток быстро кристаллизуется.

Получают 113 г 1 7й1-21 - (1-этокси0 -этилидендиокси)- -прегнен-3,2О-диона в форме желтых кристаллов с т.пл. 89-90°С.

б). 2-литровая колба Эрленмейера, которая содержит 500 мл стерилизованного 30 мин при в автоклаве питательный раствор из .3% глюкозы, .: corn steep 1, НаМОз 0,2, К Н2Р040,1; 0,2; ИдЗОд Н О 0,05, Ре5047Нг О 0,002 и КС1 0,05, засевают лиофильной культурой Culvularia Lunata NRRL (2380) и 60 ч при 30 С передвигают в ротационном встряхивателе. Эта культура выращивания (250 мл)служит для прививки 20-литрового ферментатора, который загружен с 15 л стерилизованной при 121С и 1,1 ати питательной среды, состоящей из 2 глюкозы и 2 corn steep.

Далее при добавлении силикона SH в качестве антивспенивателя при 29° С и 0,7 ати при аэрировании (10 л/мин) и перемешивании смесь герметизируют 2k ч. Затем 1,5 л этой культуры при стерильных условиях отбирают и ею заполняют 20-литровый основной ферментатор, который содержит 14 мл ранее стерилизованной питательной среды из 3% Corn steep и 0,7% глюкозы, при рН 6,5.

После фазы выроста (12 ч) при условиях предварительной ферментации при стерильных условиях добавляют 7,5 г сырого 17oL , 21-(1-этокси-этилдендиокси)-4-прегнен-3,20-диона, со держащего 6,43 г чистого-вещества, растворенного в 100 мл диметилформамида, перемешивают и аэрируют. Ход ферментации контролируют путем отбора проб, которые анализируют с помощью тонкослойной хроматографии после экстрагирования метилизобутилкетоном. Через 38 ч контакта превращение субстрата заканчивают.

Содержимое ферментатора фильтруют, фильтрат культуры, как и отфильтрованный остаток, экстрагируют.метилизобутилкетоном, экстракты объединяют и концентрируют во вращающемся испарителе, затем при 50°С бани в вакууме сгущают в ротационном испарителе до сухого остатка. Остаток рас воряют 8 теплом метаноле, отфильтро вывают от остающегося нерастворимого силиконового масла и опять упари вают до сухого остатка. Остающийся остаток (Э, г) растворяют в lO мл этилового эфира уксусной кислоты пр нагревании сначала при комнатной температуре, затем кристаллизуют пр глубоком охлаждении. Выкристаллизо вавшийся продукт отсасывают, промывают небольшим количеством уксусног эфира и сушат 5 ч при 60°С в вакуум ном сушильном шкафу. Получают 4,18 гидрокортизона (llf , lcL, 21-тригидрокси- -прегнен-3,20-дион) с т.пл. 212-2ИС. Маточник кристаллизата нагревают с активированным углем, фильтруют и концентрируют до объема 15 мл. При охлаждении и стоя нии в течение ночи при комнатной тем пературе выкристаллизовывают дальней шие 0,7 г гидрокортизона с т.пл. 208 210°С. Ойций выход 87,1 от теоретического. Пример2. а). 7 г тозилата пиридиния и 70 г 17с, 21-дигидрокси-4-прегнен-3,20-диона растворяют в 5бО мл диметилформамида и разбавля ют с 4,9 л бензола. При температуре бани отгоняют 2,1 л бензола через водоотделитель и после короткого охлаждения добавляют 168 мл три этилового эфира ортомасляной кислоты. При 130°С в течение 1,5 ч отгоняют остаточный бензол. Раствор смешивают с 8 мл пиридина и затем упаривают в ротационном испарителе в глубоком вакууме до сухого остатка. Получают 103,8 г 1 7 dl, 21-(1-эток си-бутилендиокси) -4-прегнен-3,20-диона в виде масла. б). При условиях примера 1 7,5 г сырого 17ct, -21-(1-этоксибутилидендиокси) -i-nperHeH-3,20-диона, который содержит 6,3 г чистого вещества, ферментируют 48 ч с культурой Curvularia Lunata. После переработки смеси и кристаллизации освобожденного от силикона остатка экстрагирования из этилового эфира уксусной кислоты в общем получают 4,3 г гидрокортизона с т.пл. 210-213°С. Пример 3. а) 5,3г тозилата пиридиния и 53,0 г ,21-дигидрокси-6с{-метил- -прегнен-3,20-диона растворяют в 370 мл диметилформамида и разбавляют с 2,5 л бензола. После этого отгоняют при температуре бани 130°С через водоотделитель 1 л бензола. В горячий реакционный раствор медленно добавляют 127 мл этилового эфира ортоуксусной кислоты и затем отгоняют 1 ч бензол и другие легколетучие компоненты реакции. Теперь добавляют 63 мл пиридина и сгущают при температуре бани в глубоком вакууме 2 ч полностью до сухого остатка. Остаются 66,8 г масляного d t 21-(1-этокси-этилидендиокси ) метил- прегнен- 3 , 20- диона . Пробу масляного остатка интенсивно перемешивают с дистиллированной водой, причем масло медленно переходит в кристаллическое состояние. Т.пл. 75/92-95°С. бК При условиях примера 1 в течение 51 ч с культурой Curvularia Lunata ферментируют 6 г сырого 17 , 21 - (1 -этокси-этилидендиокси) -6сА-метил- -прегнен-3,20-диона, который содержит 4,8 г чистого вещества. После переработки смеси и кристаллизации остатка экстракции из диизопропилового эфира получают З, г бЫ-метил-гидрокортизона с т.пл. 217219 0. Пример 4. а). 4 г тозилата пиридиния и ifO г 17 ci , 21-дигидрокси- 1 ,4-прегнадиен-3,20-диона растворяют в 280 мл диметилформамида и смешивают с 2 л бензола. После этого при температуре бани через водоотделитель отгоняют 600 мл бензола В горячий реакционный раствор медленно приливают 96 мл триэтилового эфира ортоуксусной кислоты и после этого отгоняют остаточный бензол и другие легколетучие компоненты реакции. Теперь добавляют 48 мл пиридина и при температуре бани 60° в течение 2 ч полностью до сухого остатка отгоняют в высоком вакууме. Получают 58 г 17of- , 21-(2-этокси-этилидендиокси)- 1 ,4-прегнпдиен-3,20-диона в виде желтого кристаллизата. Пробу кристаллизуют после обработки активированным углем из эфира с 1 ацетона и полумают чистый продукт с т.пл. 153-15 с. б 2-литровая колба Эрленмейера, которая содержит 500 мл стерилизованного в течение 30 мин при в автоклаве питательного раствора на 3 глюкозы, %: Corn steep Ь, NaN03 0,2; 0,1-, 0,2; MgS04-7H,lO 0,05; РеЗОд/НаО 0,002; и КС1 0,05 прививают с лиофильной культурой Curvularia Lunata (NRRL 2380) и 60 ч при встряхивают на ротационном встряхивателе. Эта выращенная культура служит для прививки 20-литрового форферментатора, который загружен с 15 л стерилизованной при 121°С и 1,1 эти питатель ной среды, состоящей из 2% глюкозы и 2% Corn steep при рН 6,5 При добавлении силикона SH в качестве антивспенивателя герметизируют при и 0,7 ати при аэрировании воздухом (10 л/мин) и перемешивании (220 об/мин) 2Ц ч. Затем при стерильных условиях отнимают 1,5л этой культуры при стерильных условиях и с ними прививают в 20-литровый основной ферментатор, который заполнен Н л стерилизованной, как указано выше, питательной среды из 31 Corn steep и 0,7% глюкозы, при рН 5,5. После фазы роста (12 ч) при условиях ферментации в стерильных условиях добавляют г 17с1 , 21-(1-этокси-этилидендиокси)-1,-прегнадиен-3,20-диона, растворенного в 100 мл диметилформамида, перемешивают и аэрируют дальше. Ход ферментации контролируют с помощью взятия проб, которые экстрагируют с метилизобутилкетоном и анализируют с помощью тонкослойной хроматографии. Через Зб ч контакта заканчивается превращение субстрата. Содержание ферментатора фильтруют, фильтрат культуры, так х{е, как и отфильтрованный остаток, экстрагируют метилизобутилкетоном, экстракторы объеди няют и концентрируют сначала з рота ционном испарителе, затем при бани в вакууме в ротационном испари теле и затем при 50С бани в вакуум в ротационном испарителе до 100 мл и оставляют кристаллизоваться при комнатной темг(ературе. Продукт отсасывают, сушат в вакууме и получают 5,7 г преднизолона с т.пл. 229-231°С. П р и м е р 5. а). 0,62 г тозила та пиридиния и 6,2 г D-гомо-веществ Рейхштейна S растворяют в 43, мл д метилформамида и разбавляют в 270 мл бензола. Затем при температуре ба0ни 120°С через водоотделитель отгоняют 116 мл бензола. В горячий реакционный раствор медленно добавляют Н,9 мл триметилового эфира ортоуксусной кислоты и затем 1 ч отгоняют бензол и другие легколетучие компоненты реакции. Теперь добавляют 7,5 мл пиридина и сгущают полностью до сухого остатка при температуре бани в высоком вакууме в 2 ч. Масляный остаток кристаллизуют из эфира. Получают 7,3 г 17ot, 21-(1-метоксиэтилидендиоксиО-О-гомо- -прегнен-3,20-диона в форме кристаллов с т.пл. 1б7-1б9°С. б)- в 2-литровую колбу Эрленмейера, которая содержит 500 мл стерилизованной при 120°С в автоклаве питательной среды из 3 глюкозы, %: Corn steep Ь MaNO 0,02-, КН,Р04 0,2% К,НРО 0,Ь МдЗОд-УН О 0,05, FeS04 x7H( 0,002 и KCJ 0,05, прививают лиофильную культуру Curvularia Lunata (NRRL 2380) и 60 ч при 30°С качают в ротационном встряхивателе. Выращенная культура (250 мл) служит для прививки 20-литрового ферментатора, который загружен 15 л стерилизованной при 121°С и 1,1 ати питательной среды, состоящей из 2% глюкозы и 21 Corn steep при рН 6,5. При добавлении силикона SH в качестве анти&спенивателя смесь герметизируют при 29с и 0,7 ати при аэрировании (10 л/мин) и перемешивании (220 об/мин) в течение 24 ч. Затем при стерильных условиях отбирают 1,5 я этой культуры и приливают в 20-литровый основный ферментатор, который заполнен И л стерилизованной, как указано выше, питательной среды из 3% Corn steep и 0,7% глюкозы при рН 6,5. После фазы роста (12 ч) при условиях ферментации в стерильных условиях добавляют 7,3 г 17, 21-(1-метокси-этияидендиокси)-D-гомо-А-прегнен-3,20-диона, растворенного в 100 мл диметилформамида, перемешивают и аэрируют дальше. Ход ферментации контролируют с помощью отбора проб, которые экстрагируют метилизобутилкетоном и анализируют с помощью тонкослойной хроматографии. Через А8 ч контакта превращение субстрата оканчивается. Содержимое ферментатора фильтруют, фильтрат культуры, а также отфильтрованный остаток экстрагируют метилизобутилкетоном, экстракты объединяют и сначала концентрируют в циркуляционном испарителе, затем при 50°С бани в вакууме сгущают до сухого остатка в ротационном испарителе. Остаток растворяют в теплом метаноле, отфильтровывают от остающегося нерастворенным силиконового масла и опять упаривают до сухого остатка. Оставшийся остаток хромато графируют через колонну с силикагелем (градиент ,5 л метиленхлорида на 0,5 л ацетона - л метиленхлорида на 1 л ацетона) и кристаллизуют из ацетона. Получают 5,7 г D-гомо-гидрокортизона ((Ъ, 17ci., 21-тригидрокси-0-гомо-4-прегнен-3,20-диона) с т.пл. 212-215С (с разложением). Примерб, а). 1,5 г тозилата пиридиния и 15 г l/d, 21-дигидрокси-D-roMO- 1, 4-прегнадиен-З ,20 -диона растворяют в 120 мл диметилформамида и разбавляют с 800 мл бен зола. Затем при температуре бани 120С через водоотделитель отгоняют 250 мл бензола. В горячий реакционный раствор медленно приливают 0 мл трйметилового эфира ортоуксус ной кислоты и затем отгоняют дальнейший бензол и другие легколетучие компоненты реакции. Теперь добавляют 20 мл пиридина и сгущают полностью до сухого остатка при тем пературе бани в высоком вакуум 2 ч. Остаются 18,8 г масло-кристаллического сырого продукта. Пробу перекристаллизовывают после обработ ки с активированным углем из изопропилового эфира и полумают чистый 17ot , 21-(1-метокси-этилиденокси)-D-roMo-1,-прегнадиен-3,20-дион с т.пл, 142-1 i °C б), в 2-литровую колбу Эрленмейе ра, которая содержит 500 мл стерилизованного в автоклаве при питательного раствора из глюкозы, %: Corn steep i; NaNOs 0,2; KHriP04 0,1; 0,2; MgS04-7Hi2 0 0,05; FeS04-7HijO 0,002 иКС1 0,05 прививают лиофильную культуру Curvularia Lunata (NRRL 238о) и в течение 60 ч при 30°С взбалтывают на ротационной качалке. Выращенная кул тура (250 мл) служит для прививки 20-литрового форферментатора, который загружен 15 мл стерилизованной при 121°С и 1,1 ати питательной среды, состоящей из 2% глюкозы и О10 21 Corn steep при рН 6,5. При добайлении силикона SH в качестве антивспенивателя смесь герметизируют при и 0,7 ати при аэрировании (Ю л/мин и перемешивании(220 об/мин; в течение 2Ц ч. Затем 1,5 л этой культуры отбирают при стерильных условиях и ею прививают 20-литровый основной ферментатор, который содержит И л стерилизованной, как указано выше, питательной среды из 3% Corn steep и 0,7% глюкозы, при рН.5,5. После фазы выращивания (12 ч при условиях ферментации в стерильных условиях добаапяют 7,5 г , 21- (1-метоксиэтилиденокси)-D-гомо-1,-прегнадиен-3,20-диона, перемешивают и аэрируют дальше. Ход ферментации контролируют путем отбора проб, которые экстрагируют метилизобутилкетоном и анализируют с помощью тонкослойной хроматографии. После 52 ч контакта превращение субстрата оканчивается. Содержимое ферментатора фильтруют, фильтрат культуры, а также остаток фильтрования экстрагируют метилизобутилкетоном, экстракты объединяют и сначала концентрируют в циркуляционном испарителе, затем сгущают при 50°С температуры бани в вакууме в ротационном испарителе до 100 мл и кристаллизуют при комнатной температуре..Продукт отсасывают и сушат в вакууме. Получают 6,1 г гомо-преднизолона (11/i, t7oL, 21-тригидрокси-1}-гомо-1 ,-прегнадиен-3,20-дион) с т.пл, 226228С, Формула изобретения 1. Способ получения 1 lfi-оксистероидоа общей формулы . СНгОН ОН . - простая или двойная связь-, X - водород, метилI V - метилен, этилен, включающий ферментативное гидроксилиование 11-дезоксистероидов с помощью культуры species Curvularia

Н9 065012

Lunata с последующим выделением це- ния процесса, ферментативному гидлевого продукта, отличаю- роксилированию подвергают 11-дезоксищ и и с я тем, что, с целью упроще- стероид общей формулы

О Jx., X

где1X и Y имеют указанные значения;

R -Сг2 -С4-алкиЛ)

(2 -алкил.

f5Источники информации,

принятые во внимание при экспертизе

1. Патент ФРГ № 1618599, кл.12 о 25/05,опублик.197(прототип).