Препарат иммобилизованного трипсина Советский патент 1981 года по МПК C12N9/76 

(54) ПРЕПАРАТ ИММОБИЛИЗОВАННОГО ТРИПСИНА

Изобретение относится к технике получения ферментных препаратов, а именно иммобилизованного трипсина, используемого в экспериментальной биологии и медицине.

Известен препарат иммобилизованного трипсина, включающий биоструктуру и ковалентно связанный с ней трипсин l .

Однако известней препарат обладает невысокой удельной активностью, что обусловлено тем, что применяемые носители-эритроциты обладают относительно малой способностью к активированию сшивающими химическими реагентами и последующему связыванию молекулферментов. Изготовление препарата связано с затратами больших количеств дорогостоящих кристаллических ферментов, из которых небольшая часть иммобилизуется на эритроцитах. Кроме того, в связи с малой активностью препарата для получения эффекта требуется вводить в организм его в больших дозах, содержащих балластные белки.

Целью изобретения является повышение ферментативной активности препарата.

Эта цель достигается тем, что препарат иммобилизованного трипсина, включающий биоструктуру и ковалентно связанный с ней трипсин, в качестве биоструктуры содержит тромбоциты при следующем соотношении ингредиентов, мг:

938,4-943,3

Трипсин

to 56,7-61,6 Тромбоциты

П р И м е р. Трипсин, полученный иммобилизацией на тромбоцитах кролика.

Для иммобилизации используют крис15таллический трипсин Ленинградского завода медицинских препаратов.

Свежую кровь из ушной вены кролика с добавлением 1/10 части 3,8%-ного цитрата натрия центрифу20гируют при 1000 об/мин 15 мин, обогащенную тромбоцитами плазму отсасывают и тромбоциты осаждают центрифугированием при 3000 об/мин 10 мин. Далее осадок тромбоцитов промывают

25 2 раза 0,15 М раствором хлористого натрия и взвешивают в трех объемах этого раствора. К взвеси тромбоцитов добавляют два объема 0,1%-ного раствора глутаральдегида на 0,1 М

30 фосфатном буфере при рН 6,8, содержащем 0,15 М раствора хлористого натрия и инкубируют 1-6 ч при качании на шуттель-аппарате при комнатной темп.ературе или при 4°С. Затем суспензию отмывают 4 раза 20-кратными объёмами холодного физиологического раствора до полного отсутствия глутаральдегида в последней порции отмывающего раствора.

Полученный таким образом осадок тромбоцитов инкубируют с раствором фермента на 0,1 М фосфатном буфере при рН 6,8, так, что.конечная концентрация трипсина составляет 10 мг/мл. Инкубацию проводят 1-4/ч при качании на шуттель-аппарате при комнатной температуре или при 4 С. Полученную суспензию отмывают 57 раз 20-кратными объемами холодног физиологического раствора до полного отсутствия активности фермента в последней порции отмывающего раствора. Препараты осаждают центрифугированием и хранят при 4с.

В 1 г сухого полученного препарата содержится 56,7 мг иммобилизованного фермента.

В таблице приведены данные активности предлагаемого и известного препаратов трипсина.

Эритроциты

Ковалентное связывание с помощью глутарового диальдегида

Тромбоциты

Формула изобретения Препарат иммобилизованного трипсина, включающий биоструктуру и ковалентно связанный с ней трипсин, отличающийся тем, что, с целью повышения ферментативной активности препарата, препарат в качестве биоструктуры содержит тромбоцит; ты при следующем соотношении ингредиентов . .мг,:

Результаты таблицы показывают, что при использовании предлагаемого биоструктурного носителя - тромбоцитов полученный препарат содержит в 30 раз больше активного фермента, чем при иммобилизации на известном носителе-эритроцитах.

Лабораторно изучен ряд препаратов , химически иммобилизованных на тромбоцитах ферментов, при этом установлено, что их а тивность во много раз превышает соответствующие эритроцитарные препараты. Так в 1 г сухого препарата, связанного с тромбоцитами химотрипсина, содержится 61,6 мг исходного фермента, а в препарате на эритроцитарном носителе - 0,9 мг.

Таким образом, получаемый по сравнению с известным препарат имеет повышенную ферментативную активность и может быть использован в производстве ферментных препаратов медикобиологического назначения ив лечебных целях, а также в научных институтах, занимающихся проблемами свертывания крови.

1,956,7

То же

938,4-943,3

Трипсин 56,7-61,6 Тромбоциты

Источники информации, принятые вю внимание при экспертизе

1. Терешин И.М., Москвичев Б.В. 50 Иммобилизованные ферменты. Тезисы Е Всесоюзного симпозиума. М,, 1976