Способ получения иммобилизованных протеиназ Советский патент 1988 года по МПК C12N11/06 

4

О Од

О

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к способу иммобилизации протеолитических ферментов, и может найти применение в медицине при получении препаратов иммобилизованны ферментов для лечения ран и ожогов.

Цель изобретения - увеличение протеолитической активности иммобилизованных протеиназ.

Способ заключается в адсорбции различных протеиназ на полиангидро- глюкуроновой кислоте при рН 4,4-4,6. При данных значениях рН достигается максимальное увеличение протеолити- ческой активности и выхода фермента, а снижение и увеличение рН до 4 или 5,соответственно,приводит к резкому снижению активности. При этом количество связанного с матрицей белка практически не изменяется(таблица). Способ позволяет увеличить протеоли- тическую активность целевого продукта, использовав при этом доступный и нетоксичный носитель. .

Пример 1. К1 г полиангидро- глюкуроновой кислоты (содержание карбоксильных групп 14,6%) приливают раствор, содержащий 0,5 г трипсина в 50 мл буфера с рН 4,4 (15 мл О,1 н. NaOH+50 мл 0,2 М до 200 мл), выдерживают в этом растворе в течение 24 ч при , извлекают образец из раствора, переносят его на воронку Бюхнера, промывают после- довательно охлажденным до 10°С буфером с рН 4,4, дистилированной водой до исчезновения в промывных водах реакции на трипсин. После этого образец иммобилизованного трипсина промы вают смесью вода - ацетон (1:4 по объему), ацетоном и высушивают на воздухе до воздушно-влажного состояния. Активность иммобилизованного трипсина по субстрату S-test proteaz universal составляет 9020 ед/г. Образец полностью сохраняет физическую форму исходной полиангидроглюкуроновой кислоты, .

Пример2. К1г полиангид- роглюкуроновой кислоты приливают раствор, содержащий 0,5 г трипсина в 50 мл буфера с рН 4,5 (47 мл 0,1 н. NaOH 50 мл 0,2 М KHCjH O +H O до 200 мл). Дальнейшую обработку проводят, как в примере 1. Активность иммобилизованного трипсина, определяемая по субстрату S-te st proteaza universal, составляет 10518 ед/г.

Образец полностью сохраняет физическую форму полиангидроглюкуроновой кислоты.

П р и М е р 3. К 1 г полиангидроглюкуроновой кислоты приливают раствор, содержащий 0,5 г трипсина в 50 мл буфера с рН 4,6 (90,9 мл 0,1 н NaOH + 50 мл 0,2 М до 200 мл). Дальнейшую обработку проводят, как в примере 1. Активность иммобилизованного трипсина по субстрат S-test proteaza universal составляет 9847 ед/г. Образец полностью сохраняет физическую форму исходной полиангидроглюкуроновой кислоты.

Пример4. К 1 г полиангидроглюкуроновой кислоты приливают раствор, содержащий 0,5 г химотриПсина в 50 мл буфера с рН 4,5 (47 мл 0,1 н NaOH добавляют к 50 мл 0,2 М KHCgH O и доводят дистиллированной H.jO до 200 мл). Дальнейшую обработку проводят, как в примере 1. Активность иммобилизованного химотрипсина по субстрату S-test proteaza universal сос т арляет 9600 ед/г.

11ример5.К1г полиангидроглюкуроновой кислоты приливают раствор, содержащий 0,5 г фибринолизина в 50 мл буфера с рН 4,5 (47 мл 0,1 н NaOH добавляют к 50 мл 0,2 М КНСдН О и доводят водой дистиллированной до 200 мл). Дальнейшую обработку проводят, как в примере 1. Активность им- .мобилизованного фибринолизина составляет 9010 ед/г.

Проведение иммобилизации протеолитических ферментов полиангидроглюкуроновой кислотой при рН раствора, лежащих за пределами данного интервала (4,4-4,6), приводит к резкому уменьшению активности. Так, например, активность иммобилизованного трипсина, полученного при рН 4,0 и 5,0,. составляет 4660 и 2740 ед/г соответственно При этом увеличение рН больше, чем 4,6, приводит к потере физической формы полиангидроглюкуроновой -кислоты. Дальнейшее увеличение рН приводит к повышению активности иммобилизованного фермента (таблица).

Удельную активность рассчитывают по формуле

Vfl

С

31406161

где А - активность препарата иммобилизованного фермента, ед/г носителя;

СА - содержание иммобилизованного фермента, г, в 1 г носителя; активность нативного фермента, ед/г.

ПСУ

Иммобилизация трипсина

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к способу иммобилизации протеолитических ферментов, и может найти применение в медицине при получении препаратов иммобилизованных ферментов для лечения ран и ожогов. Целью изобретения является увеличение протеолитической активности препарата иммобилизованного фермента. Способ заключается в связывании различных протеолитических ферментов на полисахаридном носителе, в качестве которого используйт поли- ангидроглюкуроновую кислоту. Проведение связывания в узкоь интервале рН (рН 4,4-4,6) позволяет достигнуть максимальной активности целевого продукта , сохранить при этом физическую форму полиангидроглюкуроновой кислоты. 1 табл.

Величина -- - представляет собой

t A

активность 1 г иммобилизованного фермента, т.е. А,уд относится к 1 г иммобилизованного фермента.

Для химотрипсина и фибринолизина получены закономерности, аналогичные приведенным в таблице.

Таким образом, использование предлагаемого способа позволяет увеличить протеолитическую активность иммобилизованных ферментов до 50-54% по сравнению с 40% для известных способов (в расчете на1г иммобилизованного i фермента). рмула изоб.ретения

Способ получения иммобилизованных протеиназ, заключающийся в их связывании с полисахариднь1м носителем с .последующим отделением целевого продукта, отличающийся тем, что, с целью увеличения протеолити- ческой активности целевого продукта и его выхода, в качестве носителя используют полиангидроглюкуроновую кислоту, а связывание проводят при :рН 4,4 - 4,6.

10

По примеру 1; По примеру 2; примеру 3.