Способ изготовления вакцины для профилактики дерматофитозов домашних и лабораторных животных Советский патент 1992 года по МПК A61K39/00 

Изобретение относится к ветеринарной микологии, в частности к профилактике де- рматофитозов животных.

Цель изобретения - повышение иммуногенности вакцины и создание иммунитета одновременно к трихофитии и микроспории.

Поставленная цель достигается тем, что в качестве вакцинных штаммов используют вирулентные культуры грибов Microsporum canis, Microsporum gypseum, Trichophyton mentagrophytes, после их гомогенизации концентрацию микроконидий взвеси Т. mentagrophytes доводят до 1 млрд 200 млн - 2 млрд в 1 мл, M. canis 600 млн - 1 млрд в 1 мл, M. gypseum - 600 млн - 1 млрд в 1 мл, после чего их смешивают в равных объемах (1:1:1), инактивируют добавлением 0,5- 0,6%-ного раствора формалина из расчета 1:1 по объему в течение 3-4 сут в термостате

при Т + 37 - 38°С, затем добавляют иммуно- модулятор - 0,8-0,9%-ный раствор нуклеината натрия в количестве 1:1 по объему, после чего взвесь расфасовывают и лиофи- лизируют.

Для изготовления вакцины используют вирулентные штаммы грибов Т. mentagrophytes, M. canis и M. gypseum, которые обладают следующими свойствами.

Штамм гриба Т. mentagrophytes.

Морфологические свойства. Штамм культивируется на сусло-агаре. При высеве уколом на чашку Петри с сусло-агаром и инкубировании при 24-28°С образует белую, бархатистую, с резко очерченными краями колонию, которая к 20-25 дню занимает всю поверхность среды. С обратной стороны колонии возможно образование коричневого пигмента. При высеве споровой взвеси культуры в матрасы с питательной

XI

СО

vj О

к:

средой к 10-15 дню развивается сплошная ровная бархатисто-пушистая, слегка поро- шистая пленка белого цвета.

Вирулентные свойства. При нанесении на скарифицированную кожу кролика эле- ментов гриба на 10-15 день образуются корочки, плотно сросшиеся с кожным покровом, на 20-25 день часто образуются толстые астбестовидные корки, некротические поражения кожной ткани, изъязвле- ния. Самовыздоровление наступает на 45-50 день.

Реактогенные свойства. Подкожное и внутримышечное введение инактивирован- ного корпускулярного антигена из культуры Т. mentagrophytes не приводит к изменению клинического состояния животных.

Антигенные свойства. Титры антител в РИГА на 20-25 день после иммунизации составляют 1:320, 1:640.

Иммуногенная активность. Иммунизация морских свинок, кроликов, собак и кошек инактивированным антигеном из культур гриба Т. mentagrophytes создает у них невосприимчивость к заражению дли- тельностью не менее 12 мес.

Была испытана иммуногенная активность трех штаммов гриба Т. mentagrophytes, обладающих вышеуказанными свойствами. Данные представлены в табл.1.

Таким образом, иммунологическая активность инактивированных антигенов из вышеуказанных штаммов не отличается, поэтому для изготовления вакцины можно ис- пользовать штаммы, обладающие вышеуказанными свойствами.

Штамм гриба М. canis.

Морфологические свойства, 18-дневная культура представлена множеством палоч- ковидных микроконидий с утолщением на одном из концов размером 3,0-6,0x0,7-2,1 мкм ровными, прямыми, извилистыми и обильноветвящимися гифами толщиной 0,7-2,6 мкм. Часто встречаются 3-8 камер- ные макроконидии.

Культуральные свойства. Штамм культивируется на сусло-агаре. При посеве уколом на чашку Петри с сусло-агаром и инкубировании при 24-28°С образует бе- лую бархатисто-пушистую колонию, которая к 20-25 дню занимает всю поверхность среды. Возможно образование желтого пигмента с обратной стороны колонии.

Вирулентные свойства. При помещении на скарифицированную кожу кроликов элементов гриба на 7-10 день наблюдается гиперемия и легкое шелушение на месте заражения. На 15 - 17 день образуются крошащиеся астбестовидные корки, плотно

сросшиеся с кожной поверхностью. На 20- 25 день наблюдения образуются корки, некротические поражения кожной ткани, изъязвления. Самовыздоровление наступает на 35-60 день.

Реактогенные свойства, При подкожном и внутримышечном введении инактиви- рованного корпускулярного антигена из культуры М. canis клиническое состояние животных не изменяется.

Антигенные свойства. Титры антител в РИГА на 20-25 день после иммунизации составляют 1:160-1:640.

Иммуногенная активность. Иммунизация морских свинок, кроликов, собак и кошек инактивированным антигеном из культуры гриба М. canis создаету них невосприимчивость к заражению длительностью не менее 10 мес.

Была испытана иммуногенная активность инактивированных антигенов из трех Штаммов гриба М. canis, обладающих вышеуказанными свойствами. Данные представлены в табл. 2.

Таким образом, иммуногенная активность инактивированных антигенов из вышеуказанных штаммов не отличается, поэтому для изготовления вакцины можно использовать штаммы, обладающие вышеуказанными свойствами.

Штамм М, gypseum.

Морфологические признаки. Зрелая 18- дневная культура представлена множеством палочковидных, овальных и круглых микроконидий размером 2,9-7,0x0,8-2,9 мкм, прямыми, извилистыми и обильноветвящимися гифами толщиной 0,7-2,6 мкм. Встречаются 3-7-камерные сигаровидные макроконидии.

Культуральные свойства. Штамм культивируется на сусло-агаре. При посеве уколом на чашку Петри с сусло-агаром и инкубировании при 24-28°С образует белесоватую и белую бархатисто-пушистую колонию, которая к 15-20 дню занимает всю поверхность среды. Возможно образование коричневого пигмента с обратной стороны колонии. При весеве споровой взвеси культуры в матрасы с питательной средой к 10- 12 дню развивается сплошная розовая бархатисто-пушистая пленка.

Вирулентные свойства. При нанесении на скарифицированную кожу кролика элементов гриба на 7-10 день наблюдается гиперемия и образование корок. На 20-22 день наблюдается образование астбесто- видных корок, при отделении которых образуются эрозии кожи, Самовыздоровление наступает на 35-55 сут.

Реактогенные свойства. Подкожное и внутримышечное введение инактивирован- ного корпускулярного антигена из культуры гриба М. gypseum не приводит к изменению клинического состояния животных.

Антигенные свойства. Титры антител в РИГА на 20-25 день после иммунизации составляет 1:160-1:640.

Иммуногенная активность. Иммунизация морских свинок, кроликов, собак и ко- шек инактивированным антигеном из культуры гриба М.gypseum создает у них невосприимчивость к заражению длительностью не менее 12 мес.

Была испытана иммуногенная актив- ность инактивированных антигенов из трех штаммов гриба М. gypseum, обладающих вышеуказанными свойствами. Данные представлены в табл.3.

Изобретение иллюстрируется следую- щими примерами.

П р и м е р 1. Культуру штаммов Т. mentagropytes, М. canis и М. gypseum выращивают в течение 15-20 дней на сусло-агаре при 26-28°С. Затем грибную массу каждой культуры снимают с поверхности питательной среды, помещают в отдельный гомогенизатор, добавляют 200-250 мл стерильной дистиллированной воды на грибную массу с 3-10 матрасов и гомогенизируют. Затем гомогенаты культур Т. mentagrophytes, содержащей 1 млрд 200 млн микроконидий в 1 мл, М. canis и М. gypseum, содержащих по 600 млн микроконидий в 1 мл смешивают по 83,3 мл. После смешивания гомогенатов добавляют 250 мл 0,5%-ного раствора формалина и полученную взвесь помещают в термостат при 37°С на 3 сут. Затем к гомогенату добавляют 500 мл 0,8 % - ного раствора нуклеината натрия расфасовывают по 2,1 мл. замораживают в течение 50 ч при -40°С и высушивают в сублимационной установке в течение 30 ч. При контроле вакцины установлено, что при высеве на МПА, МПБ, агар Сабуро, среду Китт- Тароцци она не содержит живых клеток грибов и микробной контаминации, остаточная влажность была 2,0%, концентрация в 1 мл - 200 млн микроконидий, при введении кроликам, морским свинкам, кошкам и собакам не вызывала местных и общих побочных реакций и обеспечивала создание иммунитета длительностью не менее 12 мес.

П р и м е р 2. Для изготовления 1 л вакцины берут антигены Т. mentagrophytes, М. canis и М. gypseum из живой культуры, приготовленные гомогенизацией грибницы в миксере с добавлением дистиллированной воды. Затем гомогенаты культуры Т.

mentagrophytes, содержащей 1 млрд 600 млн микроконидий в 1 мл, смешивают по 83 мл. После перемешивания гомогенатов культур добавляют251 мл 0,5%-ного раствора формалина и полученную взвесь помещают в термостат при 37°С на 4 сут. Затем к гомогенату добавляют 500 мл 0,8%-ного раствора нуклеината натрия, расфасовывают по 2,0 мл, замораживают в течение 10 ч при -45°С и высушивают в сублимационной установке в течение 32 ч. При контроле вакцины установлено, что при высеве на МПА, МПБ, агар Сабуро и среду Китт-Тароцци она не содержит живых клеток гриба и микробной контаминации, остаточная влажность 2,2%, концентрация в 1 мл 220 млн микроконидий и при введении в организм животных не вызывает местных и общих побочных реакций и обеспечивает создание иммунитета длительностью не менее 12 мес.

П р и м е р 3. Для изготовления 1 л вакцины берут антиген М. canis, Т. mentagrophytes, M. gypseum из живой культуры, приготовленной гомогенизацией грибницы в миксере с добавлением дистиллированной воды. Затем гомогенаты культуры Т. mentagrophytes, содержащей 1 млрд 600 мл микроконидий в 1 мл, культуры М. canis и М. gypseum, содержащие по 1 млрд микроконидий в 1 мл, смешиваются по 83 мл.. После перемешивания гомогенатов культур добавляют 250 мл 0,5%-ного раствора формалина и полученную взвесь помещают в термостат при 37°С сроком на 4 сут. Затем к гомогенату добавляют 500 мл 0,8%- ного раствора нуклеината натрия, расфасовывают по 1,9 мл, замораживают в течение 15 ч при -50°С и высушивают в сублимационной установке в течение 36 ч. При контроле вакцины установлено, что при высеве на МПА, МПБ, агар Сабуро и среду Китт-Тароцци она не содержит живых клеток грибов и микробной контаминации, при введении кроликам не вызывает местных и общих побочных реакций, остаточная влажность составляет 2,5%, концентрация в 1 мл 240 млн микроконидий и при введении в организм животных обеспечивает создание иммунитета длительностью не менее 12 мес.

Для профилактической цели используют вакцину против дерматофитозов, ресуспен- зированную в 1,9-2,1 мл физиологического раствора, которую вводят в область бедренной группы мышц двукратно с интервалом 10-14 дней в дозах - лабораторным животным, собакам и кошкам независимо от возраста 0,9-1.2 мл (200-250 млн микроконидий).

П р и м е р 4. Пять морских свинок, четыре кролика, пять собак, три кошки иммунизированы против дерматофитозов внутримышечно в область ягодичной группы мышц, двукратно s дозе 1 мл с содержанием 250 млн микроконидий.

При исследовании сыворотки крови в РИГА через 20 дней после второй иммунизации титры антител не выявлены При накожном заражении культурами Т. mentagrophytes, М. canis и М. gypseum через 30 дней после второй иммунизации иммунизированные животные заболели.

Две морские свинки, два кролика, две собаки и две кошки, не иммунизированные против дерматофитозов и одномоментно зараженные вирулентными культурами Т. mentagrophytes, М. canis и М. gypseum в различные участки кожи так же, как и иммунизированные, заболели дерматофитозами.

П р и м е р 5. Четыре морские свинки, три кролика, три собаки и три кошки иммунизированы внутримышечно в область бедренной группы мышц двукратно в дозе 0,9 мл с содержанием микроконидий 75 млн. При исследовании сыворотки крови в РИГА через 20 дней после второй иммунизации титры антител не превышали 1:80, При зара- жении культурами М. gypseum, М, canis и Т. mentagrophytes через 30 дней после второй иммунизации накожно не заболели дерматофитозом 2 иммунизированные морские свинки, две собаки, одна кошка, Две морские свинки, два кролика, две собаки и две кошки, не иммунизированные против дерматофитозов и засаженные вирулентнымикультурамиТ.

mentagrophytes, М. canis и М. gypseum в те же сроки и в тех же дозах, что и иммунизированные животные, заболели дерматофитозом с характерными клиническими признаками.

Длительность переболевания составила 35-65 дней (срок наблюдения).

П р и м е р 6. Восемь морских свинок, пять кроликов, четыре собаки и три кошки были проиммунизированы вакциной против дерматофитозов внутримышечно двукратно в область бедренной группы мышц в дозе 1,1 мл с содержанием 200 млн микроконидий. При исследовании сыворотки крови в РИГА через 20 дней после второй иммунизации титры антител составили 1:160-1:320. При накожном заражении культурами М. gypseum, T. mentagrophytes, M. canis через 30 дней после второй вакцинации лабораторные животные, собаки и кошки не заболели.

Три морские свинки, два кролика, три собаки и две кошки, не иммунизированные

против дерматофитозов и зараженные виру- лентными культурами грибов Т. mentagrophytes, М. canis и М. gypseum в те же сроки в тех же дозах, что и иммунизиро- ванные животные, заболели дерматофитозами с характерными клиническими признаками. Длительность переболевания составила 37-45 дней (срок наблюдения). П р и м е р 7. Пять морских свинок,

четыре кролика, пять собак и три кошки были иммунизированы вакциной против дерматофитозов внутримышечно, двукратно в область бедренной группы мышц в дозе 1,1 мл с содержанием микроконидий 250 млн,

При исследовании сыворотки крови в РИГА через 20 дней после второй вакцинации титры антител составили 1:320-1:640. При накожном заражении культурами Т. mentagrophytes, М. canis и М. gypseum через

30 дней после второй иммунизации лабораторные животные, собаки и кошки не заболели.

Две морские свинки, два кролика, две собаки и две кошки, не иммунизированные

против дерматофитозов и однократно зараженные вирулентными культурами М. canis, М. gypseum и Т. mentagrophytes в различные участки кожи так же, как и иммунизированные животные, заболели дерматофитозом с

характерными клиническими признаками заболевания. Длительность переболевания составила 35-49 дней (срок наблюдения).

Таким образом, изготовленная предлагаемым способом вакцина позволяет создать напряженный иммунитет у собак, кошек, кроликов и морских свинок без каких-либо побочных эффектов.

Формула изобретения

Способ изготовления вакцины для профилактики дерматофитозов домашних и лабораторных животных, преимущественно собак, кошек, кроликов, морских свинок, включающий подбор штаммов, выращивание культуры грибов, приготовление гомоге- ната, лиофилизацию препарата, отличающийся тем, что, с целью повышения иммуногенности вакцины и создания иммунитета одновременно к трихофитии и микроскории, в качестве штаммов используют вирулентные культуры грибов вида Microsporum canis, Microsporum gypseum, Trichophyton mentagrophytes, выращивание культур осуществляют раздельно, гомогенаты смешивают в равных объемах, полученную смесь дополнительно инактивируют 0,5-0,6%-ным раствором формалина в течение 3-4 дней при 37-38°С и добавляют 0,8- 0,9%-ный раствор нуклеината натрия в количестве 1:1.

Таблица1

Изобретение относится к ветеринарной микологии, в частности к профилактике дерматофитозов животных. Цель изобретения - повышение иммуногенности вакцины и создание иммунитета одновременно к три- хофтии и микроспории. Это достигается тем, что в качестве вакцины используют инактивированные микроконидии вирулентных грибов Т. mentagrophytes, M. canis, M. gypseum при следующем соотношении: Т. mentagrophytes с содержанием микроконидий 1 млрд 200 мм - 2 млрд в 1 мл, M. canis и M. gypseum с содержанием каждой культуры по 600 мм - 1 млрд микроконидий в 1 мл, взятых в соотношении 1:1:1 - 25-26%, 0,5-0,6%-ный раствор формалина - 25- 26%, 0,8-0,9%-ный раствор нуклеината натрия - 48-50%. Вакцину вводят внутримышечно двухкратно с интервалом 10-14 дней в зоне 0,9-1,2 мл. 3 табл. (Л С

Таблица2

ТаблицаЗ