Способ определения интенсивности дыхания микроорганизмов Советский патент 1982 года по МПК C12N1/00 

Изобретение относится к общей и технической микробиологии и может быть использовано для изучения кинетических параметров роста микробных культур, йри контроле процессов ферментации и т.д.

Известен способ определения и jтeнсивности дыхания микроорганизмов амперометрически с использЬванием электрода Кларка 1.

Недостатком известного способа является то, что он, дает заниженные величины скорости дыхания, так как в процессе отбора пробы и ее переноса в полярографическую ячейку значительная часть субстратов дыхания успевает потребиться.

Наиболее ёлизким к предлагаемому по технической сущности и достигаеMOiviy эффекту является способ определения интенсивности дыхания микроорганизмов , предусматривающий непрерывное культивирование их в аэробных условиях с последующим расчетом. Согласно этому способу измерение потребления кислорода микроорганизмами производится непосредственно в ферментере путем анализа стационарных кон1ентраций 0, и СО. в составе поступающей и выходящей из ферментера га;зовой смеси с пооледующим расчетом потребления О или выделения СО по разности 2.

Данный способ характеризуется необходимостью поддержания скорости подачи воздуха в ферментере на строго определенном уровне, использованием дорогостоящих приборов - газоанализаторов, а также низкой чувст10вительностью и надежностью определения, скорости потребления кислорода, вследствие чего данный метод позволяет получать воспроизводимые результаты лишь при измерении интенсивнос15ти дыханияплотных и быстро растущих культур.

Целью изобретения является повышение точности и чувствительности способа.

20

Поставленная цель достигается тем, что согласно способу определения интенсивности дыхания микроорганизмов, предусматривающему непрерывное культивирование их в аэробных условиях с

25 последующим расчетом, предложено в процессе непрерывного культивирования изолирование микроорганизмов от аэрирующего воздуха, измерение потребления растворенного в культураль30ной среде кислорода амперометрически, возобновление подачи воздуха и регистрация возрастания концентраци растворенного кислорода, а при расчете интенсивности дыханий проведение коррекции калибровки датчика растворенного кислорода по формуле г--с-- аЛ ° где С и С - соответственно концентрации растворенного кислорода в подаваемой среде (верхний предел насыщения кислородом п данной температуре) и микробной культуре,мкА - коэффициент массоперен са кислорода, ч ; X - био%1асса микроорганизмов, мг/л; ( - удельная скорость пот ребления кислорода, мкА/ч мг. Сущность предлагаемого способа з ключается в следующем. Скорость измерения концентрации растворенного кислорода (С) в непре рывной хемостатной культуре микроор ганизмов определяется соотношением процессов его транспорта из газовой фазы в жидкую и потребления микробной биомассой в ходе дыхания. . (1) где GO и С - концентрация растворе ного кислорода в подаваемой среде (верхний предел насыщения кислородо ПРИ данной температуре) и микробной культуре соответственно, мкА/л; KI, коэффициент массопереноса кислород X - биомасса микроорганизмов, мг/л; q - удельная скорость потре ления кислорода(§ -i-мкА/ч-мг. Стещионарные величины концентрации С могут быть найдены из уравнения (1) при условии (3c/dt О После отключения подачи воздуха культиватор массообмен между газом жидкостью прекращается т,е . Ki,p(Co С)0, и тогда скорость дыхания мик робной культуры () количествен определяется по скорости падения к центрации растворенного кислорода et;-v Возобновление подачи воздуха в культиватор приводит к увеличению со скоростью; которая может быть р считана путем интегрирования уравнения (1) при граничных условиях t О, С f . - -UrtlH -ч - -К f - -.t С, где концентрация растворенного кислорода в момент возобновления азрации.. Уравнение (4) дает возможность графоаналитического определения ко- эффициента массопереноса К, в координатах-fi, t. в. уравнении (4) вместо величины С правомерно использование любых физических величин, линейно связанных, в том числе величина напряжения растворенного кислорода Q или электрического тока в полярографическом зонде, используемом для экспериментального определенияР 4 в связи с этим калибровку полярографического зонда оказывается возможным производить непосредственно в ходе, выращивания культуЕжа, сопоставляя величины силы тока со значением С , рассчитанным по уравнению (2). Величину Сд при ЭТОМ находят из температурной зависимости растворимости кислорода в воде а К и скорость дыхания др X измеряют экспериментально. На фиг. 1 схематично изображена установка для культивирования; на фиг. 2 - электрод Кларка на фиг.З изменение концентрации кислорода. Дрожжевую культуру Debariomyces formicarius ВКМ-У-1555 выращивают при 28°С на синтетической среде следующего состава, г/л; глюкоза 0,2; (. 0,4; . 0,1;СаС1г 2Н,,0 0,02; 0,8; ЭДТА 0,005; биотин 0,00001; смесь микроэлементов. Культивирование ведут при скорости разбавления О-0,069 ч в установ- . не, изображенной схематично на фиг.1. Выращивание микробной культуры производят в стеклянном ферментационном сосуде 1 объемом 600 мл с рубашкой для термостатирующей жидкости. Перемешивание культуры осуществляют магнитной мешалкой, подачу среды перистальтическим насосом. Увлажненный стерильный воздух поступает в культуру через нижнюю часть ферментационного сосуда. Постоянство объема культуры поддерживается за счет удаления избытка микробной суспензии с током воздуха через вертикальную сливную трубку. 2, вмонтированную в пробку из нетоксичной резины 3, срезанную под углом к горизонтальной плоскости. В эту же пробку вмонтированы датчик растворенного кислорода 4, пробоотборник 5, иcпoльзye ый также для инокуляции, и толстостенный капилляр для ввода стерильной питательной среды 6. Описанная конструкция ферментационного сосуда позволяет быстро (1-2 с) изолировать культуру от атмосферного воздуха путем прекращения его подачи (перекрытие входа 7). Барботажный воздух выходит из ферментационного сосуда через отверстие в резиновой пробке с последующим установлением уровня жидкой фазы в пределах сливной трубки 2 (отмечено пунктиром). Для измерения концентрации (напрйжения) растворенного кислорода используют малоинерционный и вьщерживающий стерилизацию автоклавированием модифицированный электрод Кларка, который состоит (фиг. 2) из двух стеклянных деталей - корпуса 8 и стержня 9, несущего платиновый катод 10 в торцовой части, и серебряный анод 11 в виде пластины или спи|рально накрученной вокруг стержня проволоки. Стержень 9 пришлифован к нижней части корпуса датчика, что Qa ет возможность фиксировать катод в строго определенном положении. Между пришлифованными поверхностями оставлен канал 12 (за счет того, что стержень имеет в поперечном сечении форму круга, усеченного по хорде), наличие которого необходимо для продолжительной работы датчика. Нижнее отверстие корпуса 8 закрывают фторопластовой мембраной 13 (F-4 , толщина 12 мкм), фиксирует ее кольцом из селиконовой резины 14 и эпоксидным клеем 15. Затем в корпус вводят элек |тролит (1н NaCl) и стержень 9 с элек тродами, укрепляя последний в верхне части корпуса резиновой прокладкой 1 и парафидом. Окончательную сборку датчика (введение электрсшита и установку электродов) производят после автоклавирования (0,5 атм, 30 мин) корпуса 8с мембраной 13 в составе полностью собранной установки для непрерывного культивирования микроорганизмов. После стабилизации культуры (3 су после инокуляции) производят измере.ние интенсивности дыхания: прекрёица1ют подачу воздуха в ферментатор и регистрируют концентрации растворенного кислорода (фиг. 3), затем возоб новляют подачу воздуха и регистрируют возрастание концентрации растворенного кислорода. Величину KI, рассчитывают .по уравнению (3)-13 ч ; значениеС по уравнению (2) оказывается равным 459 мкА O,j/ И скорость дыхания культуры (по уравнению 3)мкА3 -час °2.Предлагаемый способ позволяет повысить надежность и чувствительность определения интенсивности дыхания микроорганизмов более чем в 20100 раз, по сравнению с известным способом, дает хорошо воспроизводимые результаты с относительной ошибт кой определения, не превышающей .2%. Формула изобретения Способ определения интенсивности дыхания ми кроорганизмов, предусматривающий непрерывное культивирование их в аэробных условиях с последующим расчетом, отличающийся тем, что, с целью повышения точности и чувствительности способа, в процессе непрерывного культивирования микроорганизмы изолируют от аэрирующего воздуха, измеряют потребление растворенного в культуральной среде кислорода амперометрически, возобновляют подачу воздуха и регистрируют возрастание концентрации растворенного кислорода, э. при расчете интенсивности дыхания проводят коррекцию калибровки датчика растворенного кислорода по формуле где GO и С - соответственно концентрации растворен-ного кислорода в подаваемой среде (верхний предел насы1цения кислородом при данной температуре) и микробной культуре,мкЛ/л; К. - коэффициент массопереноиОс.а кислорода, ч ; X - биомасса микроорганизмов, q, - удельная скорость . ребления кислорода, мкА/ч- мг. Источники информации, принятые во внимание при экспертизе 1.Шольц К.Ф., Островский Д.Н. Ячейка для амперометрического определения кислорода. В сб.. Методы современной биохимии , 1975, М., Наука, с. 52-58. 2.Olijve W. Kok I.I. Analysis of growth of gluconobacter oxydans in glucose containing media. Arch.Microbiol, 1979, 121,3, p. 283-290.

К

i

-9 Nf

-tf

15 -13 C,nHAf/i юо no т tea