СПОСОБ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ L-ПРОЛИНА Российский патент 1997 года по МПК C12P13/24 C12Q1/02 C12Q1/06 C12N1/20 C12N1/20 C12R1/38 

Изобретение относится к микробиологической промышленности, в частности к способам количественного определения концентрации L-пролина с помощью штамма Pseudomonas species Ш-22 ВКПМ В-4877, специфически окисляющего L-пролин.

Изобретение наиболее эффективно может быть использовано в микробиологической и пищевой промышленности, клинических и лабораторных исследованиях.

Основными требованиями, предъявляемыми к современным методам количественного определения аминокислот, являются высокие чувствительность, селективность, простота, минимальное количество стадий; отсутствие необходимости применения токсичных соединений в процессе анализа; в случае методов, основанных на использовании микроорганизмов, последние не должны быть патогенными и спорообразующими.

Этим определяется широта областей применения метода.

Известные методы определения L-пролина, такие как хроматографические, электрофоретические [1] колориметрический [2] не в полной мере удовлетворяют современным требованиям. Эти методы достаточно трудоемки и длительны. Их реализация предусматривает использование токсичных соединений.

Описанный микробиологический метод определения L-пролина основан на применении тест-культур, способных расти только на средах, содержащих L-пролин.

В частности, в работе [3] в качестве тест-культуры используют штамм спорообразующих бактерий Neurospora crassa.

Основными недостатками этого способа являются длительность анализа (ввиду низкой скорости роста время анализа достигает 200 ч); низкая специфичность анализа, обусловленная тем, что данные клетки способны расти на средах, содержащих пептиды и белки, что делает невозможным определение пролина в многокомпонентных средах; Neurospora crassa относится к спорообразующим микроорганизмам, вследствие чего она является источником загрязнения лабораторных и производственных помещений.

Наиболее близким к предлагаемому является способ количественного определения L-пролина с помощью мутантного штамма E. coli P-69 [4] Метод основан на том, что интенсивность роста клеток E. coli P-69 линейно зависит от содержания L-пролина в среде роста. Для проведения анализа клетки E. coli P-69, ауксотрофные по L-пролину, выращивают в 2 мл питательного бульона, переносят в синтетическую среду M-9, содержащую 10 мкг/мл L-пролина, и инкубируют 16 ч при 37^oC. До начала определения культуру центрифугируют и ресуспендируют в стерильной минеральной среде M-9. Исследуемые образцы стерилизуют в автоклаве при 1 атмосфере 30 мин и центрифугируют (4000 об/мин, 20 мин). Супернатант инкубируют на кипящей водяной бане, повторно центрифугируют, разводят в соответствующее число раз, после чего вносят штамм E. coli P-69 и выращивают в течение 20 22 ч при 37^oC. Затем фотометрически оценивают интенсивность роста клеток в анализируемых образцах и по стандартной кривой определяют концентрацию в них L-пролина. Основными недостатками данного способа, существенно снижающими эффективность анализа, являются низкая скорость роста клеток (20 22 ч), многостадийность и трудоемкость предобработки исследуемых образцов, обуславливающие длительность анализа.

Цель изобретения разработка быстрого, простого и селективного способа количественного определения L-пролина с помощью свободных и иммобилизованных клеток Pseudomonas species Ш-22, которые окисляют L-пролин и не окисляют другие аминокислоты и сахара.

Ожидаемыми эффектами от изобретения является увеличение скорости анализа за счет упрощения процесса определения и улучшение экологического аспекта анализа за счет исключения стадий использования токсических агентов и регулярного наращивания бактериальной биомассы.

Предлагаемый способ количественного определения L-пролина основан на свойстве клеток Pseudomonas Sp. s Ш-22 (ВКПМ В-4877) окислять L-пролин, причем скорость окисления L-пролина свободными или иммобилизованными клетками (скорость потребления кислорода клетками в присутствии L-пролина в реакционной среде) линейно зависит от концентрации L-пролина в диапазоне концентраций последнего от 0,01 до 0,1 мМ. Сущность способа состоит в том, что проводят окисление L-пролина свободными или иммобилизованными клетками и регистрируют скорость потребления кислорода. По скорости потребления кислорода определяют концентрацию L-пролина в среде. Скорость потребления кислорода определяют амперометрически с помощью мембранного кислородного электрода Кларка [5] и выражают как количество кислорода (ммоль), потребленное 1 мг клеток (влажный вес) в одну минуту.

Используемый штамм Pseudomonas species Ш-22 ВКПМ В-4877 непатогенен для человека и не является спорообразующим.

Штамм Pseudomonas species Ш-22 хранится во Всесоюзной коллекции промышленных микроорганизмов института "ВНИИГенетика" (Москва), N В-4877.

Пример 1. Клетки Pseudomonas species Ш-22 (ВКПМ В-4877) выращивают на синтетической среде, содержащей 0,15: L-пролина, 0,02: K₂HPO₄•3H₂O, 0,05: KH₂PO₄, 0,02: MgSO₄•7H₂O, pH 7,2 7,5, при 30^oC в 750 мл конических колбах (объем ферментационной среды 200 мл) на круговой качалке (180 об/мин) в течение 16 часов. Биомассу отделяют центрифугированием (10000 об/мин. 15 мин), суспендируют в 50 мМ калий-фосфатном буфере pH 7,2 в соотношении 0,2 г клеток (влажный вес) в 1 мл буфера. Скорость окисления L-пролина определяют амперометрически по изменению содержания кислорода в реакционной среде. Для этого измерительную ячейку (объем 5 мл), снабженную перемешивающим устройством, наполняют 50 мМ калий-фосфатный буфер pH 8,0, добавляют 0,05 мл клеточной суспензии и вводят 0,05 мл раствора L-пролина известной концентрации (0,01; 0,02; 0,04; 0,06; 0,08; 0,1; 0,3; 0,5; 0,7; 0,9; 1,0 мМ). С помощью самописца регистрируют скорость потребления кислорода клетками в присутствии L-пролина. Каждое измерение повторяют не менее трех раз и определяют среднее значение. На основании полученных результатов строят калибровочную кривую (фиг. 1). Наиболее удобным для проведения анализа является диапазон от 0,01 до 0,1 мМ L-пролина.

Пример 2. Условия культивирования клеток и определения такие же, как в примере 1, только для анализа используют клеточную суспензию, которую хранят при 4^oC на протяжении 14 дней. Скорость окисления L-пролина остается постоянной при хранении биомассы в течение 10 дней (табл.1).

Пример 3. Культивирование клеток и определение скорости окисления L-пролина проводят как в примере 1, только вместо свободных используют иммобилизованные клетки. Для этого выращенную биомассу включают в Ca-альгинатный, или каррагинановый гели [6] либо в криогель поливинилового спирта. Содержание клеток в гелях составляет 10% Для проведения анализа в измерительную ячейку помещают 10 мг иммобилизованных клеток. Для каждого измерения используют новую порцию иммобилизованных клеток. При работе с клетками, иммобилизованными в Ca-альгинатный гель, измерения проводят в 50 мМ Трис-HCl буфере pH 8,0. При работе с клетками, иммобилизованными в каррагинановый гель или поливиниловый спирт используют, как и в примере 1, 50 мМ калийфосфатный буфер pH 8,0. Диапазон определяемых с помощью иммобилизованных клеток концентраций L-пролина такой же, как для свободных (фиг.2). На фиг.2 имеются следующие обозначения: 1-Ca-альгинатный гель, 2-криогель поливинилового спирта, 3-каррагинановый гель.

Пример 4. Условия определения такие же, как в примере 2, только для определения используют иммобилизованные клетки, которые хранят при 4^oC в соответствующем буфере. На шестидесятый день хранения скорость окисления L-пролина иммобилизованными клетками составляет 80% от начальной. (табл.2).

Пример 5. Условия определения такие же, как в примере 3, только все измерения проводили на одной и той же порции иммобилизованных клеток. После каждого измерения иммобилизованные клетки трижды промывали рабочим буфером и использовали для повторного измерения. При проведении 10 анализов на одной и той же порции иммобилизованных клеток скорость окисления L-пролина оставалась неизменной (табл.3).

Пример 6. Определение L-пролина проводят как в примерах 1, 2, 3, 4, 5. Для определения L-пролина в сложных биоорганических жидкостях; ферментационных средах, гидролизатах БВК, мелассе и вине анализируемые пробы центрифугируют (10000 об/мин, 15 мин), при необходимости, разводят в нужное число раз 50 мМ калий-фосфатным буфером pH 8,0 таким образом, чтобы содержание аминокислоты укладывалось в стандартную калибровочную кривую и проводят определение, как описано в примере 1 (или в примере 2, если определение проводят иммобилизованными клетками). Каждое измерение повторяют три раза (время одного измерения составляет 5 минут). Вычисляют среднюю величину скорости окисления L-пролина и по калибровочной кривой определяют содержание L-пролина в пробе.

Минимальная концентрация L-пролина, определяемая с помощью клеток Pseudomonas species Ш-22 (ВКПМ В-4877), составляет 0,01 мМ. В диапазоне концентраций L-пролина от 0,01 до 0,1 мМ скорость окисления L-пролина линейно зависит от концентрации этой аминокислоты в реакционной среде.

Предложенный способ количественного определения L-пролина, основанный на применении штамма Pseudomonas sp. Ш-22 (ВКПМ В-4877), обладающих свойством окислять L-пролин, отличается селективностью, высокой скоростью анализа, простотой, исключает необходимость регулярного наращивания биомассы, при использовании иммобилизованных клеток позволяет многократно использовать одну и ту же порцию биокатализатора. С помощью данного способа можно проводить определения L-пролина в сложных биоорганических растворах.

Использование: в биотехнологии, микробиологической промышленности. Сущность изобретения: предлагается способ количественного определения L-пролина, основанный на том, что скорость окисления L-пролина свободными или иммобилизованными клетками Pseudomonas species Ш-22 (ВКПМ В-4877) линейно зависит от концентрации L-пролина в диапазоне концентраций последнего от 0,01 до 0,1 мМ. Предлагаемый способ количественного определения L-пролина выгодно отличается от уже известных высокой селективностью, высокой скоростью анализа (время одного измерения 5 мин), отсутствием необходимости регулярного наращивания биомассы, возможностью многократного применения иммобилизованных клеток для проведения анализа. Используемый штамм Pseudomonas species Ш-22 (ВКПМ В-4877) непатогенен для человека и не является спорообразующим. Изобретение наиболее эффективно может быть использовано в микробиологической промышленности, в виноделии, клинических и лабораторных исследованиях. 2 ил. , 3 табл.

Способ количественного определения L-пролина, основанный на применении микробных клеток, способных расти на средах, содержащих в качестве единственного источника углерода и азота L-пролин, отличающийся тем, что концентрацию L-пролина определяют по скорости его окисления свободными или иммобилизованными клетками бактерий Pseudomonas species Ш-22 (ВКПМ В-4877).