Способ получения ферментов 1.4.1.3,1-глутамат: АД( @ )+ -оксиредуктазы и 1.4.1.4,1-глутамат: АД( @ )+ -оксиредуктазы(дезаминирующих) Советский патент 1983 года по МПК C12N9/06 

Изобретение относится к физико-хи мической биологии и биотехнологии, в частности.к способам получения и очистки ферментов.

Известен способ получения изо:.ферментов.путем аффинной хроматографии LI ЗУказанный способ является достаточно трудоемким и длительным.

Наиболее близким к предлагаемому по технической сущности и достигаемок(у эффекту является способ разделения ферментов 1.А.1.3,1-глутамат: NAD (Р)-оксидор.едуктазы и 1.4.1.4, L-глyтaмaт:NAD Р -оксидоредуктазы на одноклеточных зеленых водорослях, включающий пблучение .экстракта из клеток водорослейС23,

Разделение .глутаматдегидрогеназ по известному способу предусматривает подготовку колонки с ДЭАЭ-целлюлозой , которая заключается в обработке ионообменника 0,5М НС1 ,а затем 0,5М NaOH с последующей отмывкой на воронке Бюхнера большим объемом дистиллированной воды до нейтральной реакции; заполнение колонки заряженной 1ДЭАЭ-целлюлозой и уравновешивание ее стартовым буфером; предварительную очистку бесклеточного экст- ракта от мешающих ионообменной хроматографии хлорофилл-липопротеидных комплексов, которая осуществляется осаждением белков сернокислым аммонием от 35 до б5 % от насыщения с пос/1едующим обессоливанием белкового препарата на колонке с Сефадексом С-25;нанесение белкового препарата, содержащего разделяемые ферменты, на готовую колонку с ДЭАЭ-целлюлозой; промывку колонки стартовым буфером с целью удаления несвязывающегося с ДЭАЭ-целлюлозой белка; ступенчатую элюацию семью буферными растворами повышающейся ионной смолы, так как NAD (Р)-глутаматдегидрогеназа (1.4 . КЗ, L-глутамат: NAD (Р) оксидоредуктаза) смывается с колонки 0,08-0,1Мфосфатным буфером, а NAD Рглутаматдегидрогеназа (1.4.1.4;1 глуTaMaT:NAD Р-о сидоредуктаза)-0,2М NaCl в 0,1М фосфатном буфере.

Вся процедура занимает 58-60 ч. Данные по разделению глутаматдегидрогеназ из Chlorella pyrenoidosa 82 Т с помощь 10 ионообменной хроматографии представлены в табл. 1.

Таблица

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ФЕРМЕНТОВ 1 .i.1.3, 11ГЛУТАМЛТ:НАО(Р)+.ОКСИДОРЕ1ДУКТАЗЫ И 1.1. 1.1, 1-ГЛУТАМАТ;МАО Р -ОКСИДОРЕДУКТАЗЫ (ДЕЗАМИНИРУЮЩИХ) путем экстракции одноклеточных зеленых водорослей фосфатным буфером с последующим фракционированием экстракта , о т л и ч ею щ и и с я тем, что,с целью ускорения способа и увеличения выхода каждого фермента, в экстракт добавляют хлористый марганец до конечной концентрации 0,025-0,030 М,осадок фосфата марганца, сорбирующий 1..1.3 1-глутамат: NAD (Р) -оксидоредуктазу, отделяют от жидкой фазы, содерi жащей 1Л.1. t-глутамат: NAD .ксидоредуктазу, центрифугированием и 1.it.1.3, L-глутамат: NAD(P)-оксидоредуктазу элюируют с осадка 0,1 - О,2М фосфатным буфером. О 4 О) СО

Бесклеточный iBKCTpaKT

Высаливание сернокислым аммонием, фракция 35-65 от насыщения

30,4 0,0

36,7

202

0,212

1 100

0,02.1

0,028

0,257

1,25 50

12,6 0,0

0,413

14,3 24

0,0 5,500

26

56

0,0 к не/цостаткам способа относится то, что разделение NAD (р)тлутаматдегидрогеназы и NAD Р-глутаматдегидрогеназы является длительным, трудоемким, требует обязательной предварительной очистки и дает относительно низкий выход ферментов. Кроме тог ДЭАЭ-целлюлоза является дефицитным импортным материалом. Цель изобретения - ускорение способа и увеличение выхода ферментов. Поставленная цель достигается тем, что согласно способу получения ферментов 1 .4.1.3,1--глутамат:МАО (Р) оксидоредуктазы и 1.4.1.4.1-глутамат :NAD Р оксидоредуктазы (дезаминирующих) путем экстракции одноклеточных зеленых водорослей фосфатным буф.ером с последующим фракционированием экстракта,в экстракт добавляют хлористый марганец до конечной концентрации 0,025-0,030 М, осадок фосфата марганца, сорбирующий 1 .V. 1.3,L глутамат:МАО (Р)-оксидоредуктазу,от деляют от жидкой фазы, содержащей 1.4.1.4, L-глутамат: NAO Р /оксидоредуктазу, центрифугированием и 1.. L-глутамат: NAD (Р) оксидоредуктазу элюировать с осадка О,1-0,2 М фосфат ным буфером. I П р и м е р. мл охлажденного до 5-7°С экстракта в 0,05М фосфат ном буфере (рН 7,4) из одноклеточной

Бесклеточный

3790 496 зкстракт

0,0 779 0,0 2290

170 0,0 0,47 1010

948 0,13

0,25

1 100

0,34

1,4 82

3,6 95

0,0 31 . .4 зеленой водоросли Ankistrodesmus braunii (в случае другой водоросли температура экстракта можетбыть повышена до ), содержащего NAD (Р)глутаматдегидрогеназу и NAD Р-глутаматдегидрогеназу, по каплям при интенсивном перемешивании добавляют раствор MnCl2 (из расчета 2,5 мл 1М раствора МпС12-на 100 мл экстракта) . В этих условиях в течение 20. мин происходит образование и формирование осадка фосфата марганца, на котором адсорбируется NAD (Р))глутаматдегидрогеназа. Образовавшийся осадок отделяется от надосадочной жидкости, содержащей NAD Р- . глутаматдегидрогеназу, центрифугированием при 8000 g в течение 30 мин и для удаления захваченных осадком лишних белков,промывается 100 мл 0,01м фосфатного буфера рН 7,4.Элюция NAD (Р)-глутаматдегидрогеназы с осадка осуществляется О,Ж фосфатным буфером рН 7,4 двумя порциями по 100 мл.Объединенный элюатсЬдержит практически всю NAD (Р)-глутаматдегидрогеназу, а .в надосадочной жидкости сохраняется более 80 NAD Р- глутаматдегидрогеназы. Вся. процедура занимает 2,5 ч. Результаты разделения глутаматде- . гидрогеназ предлагаемым способом представлены в табл.2. Т а б л и ц а 2 i

Таким образом, предлагаемый спо-тов (по известному способу выход поссоб разделения глутаматдегйдрогеназпе разделения 56 и для NAD (Р)по сравнению с известным не требуетглутаматдегидрогеназы и NAD Р- глут апредварительной очистки ферментов,т.е.матдегидрогеназы соответственно, а

позволяет разделить их уже на ста- 5по предлагаемому способу 90 и 82);

дии бесклеточного экстракта; значи-существенно снижается трудоемкость

тельно сокращает время,необходимоеи удешевляется весь процес раздля разделения (с 58 до 2,5 ч, т.е.деления за счет исключения коболее чем в 20 раз); кроме того,уве-лоночной ионообменной хроматогра ичивается выход разделяемых фермен- Офйи.