Способ получения ферментационного бульона Советский патент 1982 года по МПК C12P19/06 

вующего образованию хелатных соеди нений, вводят этилендиаминтетрауксусную кислоту. После культивирования в ферментационный бульон вводят формальдегид в количестве 0,2-10 г/л. В качестве источника азота используют нитраты аммония, натрия и калия. Вода для приготовления питательной среды содержит менее чем 20 г/л кальция и других осаждающих в виде фосфатов катионов, После культивирования ферментацион . ный бульон выдерживают в течение 3-4 дней для получения бульона, прак-t тически свободного от нерастворимых частиц, превышающих размер 0,65 мкм. Средой для выращивания данного мик роорганизма может быть бульон УМ (Difco) или среда, содержащая неочищенную глюкозу (церелозу), фосфаты натрия и калияj сульфат магния и любое органическое соединение, являюще ся источником азота, например энзимную выварку соевых бобов или энзимную выварку казеина. После аэробно го размножения в течение примерно 30 ч при 25°С аликвоту бульона переносят в ферментер для осуществления второй стадии инокуляции. Предпочтительными углеводами являются глюкоза, мальтоза, фруктоза, отфильтрованный крахмал или их смеси. Предпочтительным источником азота является неорганический нитрат: нитрат аммония, нитрат натрия и нитрат калия в заданных концентрациях. Магний, как один из необходимых микроэлементов, используют в виде MgSO -7HnO, или горькой соли, добавляя ее в концентрации до 1 г/л, наряду с наличием следов магния и железа. Веществом, способствующим образЪванио хелатов, является этилендиаминтетрауксусная кислота или, предпочтительно, лимонная кислота, которая используется в качестве реагента, спо собствующего росту, а также пассивато ра /У1Я кальция. В качестве буфера для среды, обеспечивающего значение рН 5 8,5 предпочтительно 6,0-7,5 вводят большое количество моно- и дифосфатов калия. .После аэробного размножения в течение ч при , предпочтительно при 28-30°С, аликвоту раствора вносят в бродильный чан, содержащий .обеспечивающую получение вещества среду. Эта среда подобна по составу среде, находящейся во йторой стадии инокуляции, за исключением того, что вместо фосфатов калия предпочтительно используют фосфаты натрия (в связи с их низкой стоимостью) и малое количество кальция в форме солей, таких как хлористый кальций или нитрат кальция, или окислов, которые добавляют для увеличения выхода ксантана. Количество добавляемогокальция зависит от количестна кальция, присутствующего в воде, используемой при приготовлении среды, используемого источника получения азота и видов и цепей используемого микроорганизма Xanthomonas Если вместе нитрата аммония используют нитрат .натрия или калия, требуется меньшее количество кальция (примерно 27 Ч. на млн). Для полумения среды можно использовать такие деионизован-т 1Уую воду, дистиллированную воду- или 1 воду, содержащую менее 20 ч на млн. кальция и других осаждаемых при образовании фосфатов катионов, Ионы кальция можно добавлять в требуемой концентрации. Роль ионов кальция в обеспечении получения ксантата велика,.но для предложенного способа наиболее существенным является предотвращение избыточного осаждения катионов кальция и других катионов в виде нерастворимых фосфатных солей. Это осуществляют путем добавления реагента, способствующего образованию хелатов, такого как этилендиаминтетрауксусная кислота. Важным параметром для обеспечения роста бактерий Xanthomonas является рН среды. Предпочтительными значениями являются величины от 6,0 до 7,5. Регулирование рН в указанных пределах осуществляют использованием буферных соединений, таких как динатрийфосфат, Для предотвращения осаждения ионов кальция введенных в воду, в виде нерастворимых солей кальция в буфер добавляют этилендиаминтетрауксусную кислоту. Пpeдпoчtитeльнo регулировать рН в ходе цикла ферментации путем добавления растворов гидратов окиси натРйя или калия, при использовании которых обеспечивается дополнительное преимущество, заключающееся в уменьшении вязкости бульона без уменьшения выхода ксантана и в отсутствии необходимости хелатации буферного раствора. Для быстрой ферментации необходимо точное количество кислорода, обеспе595чивающее рост бактериальной культуры. Ферментационную среду аэрируют с целью обеспечения требуемого количества кислорода для получения значения сульфитного окисления, в пределах от 1,5 до 3,5 ммоль кислорода на литр в минуту. Величина сульфитного окисления является мерой скорости кисло. рода на входе в бродильный чан при перемешивании и осуществлении аэрации Ферментацию проводят при температуре около до тех пор, пока концентрация ксантана в бульоне не станет по крайней мере 100 ч. на млн., предпочтительно около 1 и наиболее предпочтительно около 1,k% (30-96 ч). Вязкость раствора составляет обычно 4,000 сП, предпочтительно 7,000 сП. Желательно убивать микробные клетки путем добавления бактерицида. Пред почтительным бактерицидом является формальдегид в концентрации 0,210,2 г/л, который может быть добавлен на заключительной стадии Ферментации, до или во время хранения. Предложенный способ пригоден для работы со многими вариантами бактерий Xanthomonas. Предпочтительным видом является Xanthomonas carnpestris. Испытание на фильтруемость является экспериментальной методикой, при которой измеряется скорость протекания через фильтр, имеющий микропоры размером 0,45-3,0 мкм, как функция от объема при постоянном давлении (2,82 кг/см ). Фильтрационное отношение соответствует отношению периода времени, необходимого для собирания четвертых 250 мл раствора для регулирования подвижности, к времени, которое необходимо для собирания первых 250 мл этого раствора. Фильтрационное отношение, равное 1 свидетельствует о том, что раствор не обладает тенден - -цией к забиванию. Допустимые значения фильтрационных отношений для растворов для регулирования подвижности составляют 1-3 (микропористые фильтры с размером пор 0,45-3 мкм), предпочтительно 1,7. Требуемые значения фильтрационных отношений и размеры пор фильтров, используемых для испытаний конкретного раствора.для регулирования подвижности, зависят от проницаемости подземных слоев нефтяного месторождения, для которого планируется вытеснение нефти. Растворы для регулирования подвижности на основе завершенных ферментационных растворов, полученных в соответствии с предложенным способом, имеют фильтрационные отношения, которые пригодны для большинства нефтеносных месторождений. Если проницаемость подземных слоев очень низкая, то используют растворы для регулирования подвижности с малыми фильтрационными отношениями, причем целые или неочищенные бульоны предпочтительно не должны иметь никаких нерастворимых веществ с размерами частиц, превышающими 0,б5 мкм. Это можно осуществить простым хранением готового ферментационного бульона в присутствии формальдегида в течение дней. В процессе старения клетки Xanthomonas сжимаются таким образом, что их размеры не превышают 0,б5 мкм. Клетки, имеют форму стерхшя, причем обычно наибольший размер по длине превышает 0,65 мкм а меньший размер составляет 0,4-1,0 мкм., Температура хранения некритична (О135°С, предпочтительно 20-45 0). На практике хранение при комнатной температуре в течение длительного времени осуществляется до тех пор, пока микроскопическое исследование не показыва- ет, что наименьший размер клеток не превышает 0,5 мкм (через 3-4 дня). Методики испытаний. Готобят 1000 мл раствора, содержащего 750 ч. -на млн. ксантана в растворе соли с концентрацией 500 ч. на млн (10:1 NaCJ-CaCl), следующим образом. В смесителе типа Варинга (Waring), снабженном реостатом, замеряют количество бульона (основываясь на содержании ксантана), необходимое для получения 0,75 г твердого ксантана, Проводят разбавление от 1 до 6 раствором соли. Сдвигают смесь следующим образом: 40% мощности (2 мин 60 мощности) 2 мин, 80 мощности 2 мин. Разбавляют раствор в смесителе до концентрации ксантана 750 ч. на млн. и сдвигают при 40% мощности в теуение 2 мин (раствор также используют для определения вязкости). Используют экспериментальное устроиство, которое позволяет определять скорость протекания через диск из микропористого фильтра (47 мм, размер пор 0,46-8,0 мкм) как функцию от объема при постоянном давлении в 28 н/м . Резервуар емкостью 1 л заполняют 1 л ксантанового раствора (750 ч.

а млн.), создают давление 28 H/M, отpbiBarot клапан и регистрируют объем ильтрата и время (с).

Определяют фильтрационное отношеие.5

Определение вязкости. Вязкость опеделяют с помощью синхроэлектрического вискозиметра Брукфильда (модель LVT с VL-приставкой). Измерения ведут . при 25°С и скоростях 6 и 12 об/мин. ю Вязкость выражают в сантипаузах,

Определение содержания ксантана. Ксантан высокой степени очистки содерит около 18, глюкуроновой кислоты. Количество глюкуроновой кислоты в ком-is позициях на основе ксантана определяют в отсутствие формальдегида и без бората при по методу Кнутсона и Джинса.

Содержание ксантана определяют по 20 формуле

Глюкуроновая кислота, % к ТОО о,

., fgnp

Пример 1. Клетки Xanthomonas campestris из косого агара переносят в 300 мл бульона УМ, находящегося в Z,, 8-литровой колбе Фернбаха, и встряхивают на вращающемся шейкере в течение 31 ч при 28°С. Аликвоту 25 мл переносят в колбу Фернбаха (2,8 л) , содержащую 500 мл среды следующего состава, г/л:

Глюкоза-фруктоза

(Изосвит 100) 10,1

Неочищенная глю-3S

коза (церелоза) 25,1

NH4N031,0

MgS04-7H iO0,10

MnS04HiO0,03

FeS04-7HxO0,0140

Безводная лимонная

кислота1 0

КаНР04,1

KHaPL40,69

Церелозу и Изосвит 100 растворя- ют в дистиллированной воде и обрабатывают в автоклаве по отдельности. Остальные ингредиенты объединяют, доводят рН до 6,Ц.и также обрабатывают в автоклаве. Прошедшие раздельную об-работку в автоклаве материалы затем объединяют вместе.

После встряхивания при 28С в течение 33 ч 200 мл раствора перемеща- ют в 4-литровый ородильный бак с механической мешалкой, содержащей 2 л среды следующего состава, г/л:

Церелоза 25,7 автоклавируют ю отдельности. Изосвит 100 10,1 NH4H031,0

MgS047H-iO0,10

,03

FeS04-7H,2.00.10

Безводная лимонная кислота1,0 СаС1-2Но О 0,20 NaHP04 3,3 0,70 Сахара растворяют в 300 мл воды, .обрабатывают в автоклаве по отдельности, остальные ингредиенты растворяют в 1700 мл воды, обрабатывают в автоклаве, после чего объединяют оба раствора. Затем проводят аэрацию с такой скоростью, чтобы обеспечить количество кислорода 1, ммоль/л в минуту

Ферментацию проводят при 30°С в течение 8 ч, при этом рН раствора поддерживают на уровне 5-7,5 добавлением буфера на основе фосфата натрия разведенного Ъ водопроводной воде. В буфер на основе фосфата натрия добавляют также этилендиаминтетрауксусную кислоту для предотвращения осаждения фосфата кальция. В конце ферментации вязкость бульона 7ВОО сП (при скорости сдвига 6,27 ), выход ксантана 1,5.

Раствор для регулирования подвижноти имеет фильтрационнЬе отношение 1,7 (микропористый фильтр с размером пор 3 мкм).

Пример 2. Повторяют методику примера 1 с использованием следующей ферментационной среды, г/л:

Г1осевная среда 1-я стадия Церелоза10,0

(NH4)T.HP042,0

KHQ,P041,0

MgS04-7HlO0,5

NZ-амин УТ (энзимная выварка казеина) рН -7,0 11,0 Посевная среда (2-я стадия/ D-глюкоза

(о(5рабатывают в автоклаве по отдельности)27,0 D-фруктоза3,0 NH4H031,0 HgS04.,10 Мп504-Н200,03 FeS04- 7НаО0,01 Безводная лимонная кислота1,0 , I ,69 Среда,для полученияпродукта О-глюкоза (обрабатываются в автоклаве по отдельности)27,0 О-фруктоза3,0 Безводная лимонная кислота1,0 NH4N031,0 Мд504-7Н О0,10 ,03 FeS04-7H-iOр,01 CaClQi-2H O0,20 Na HP043,3 НаН-тР040,70 Ферментацию осуществляют так же, как и в примере 1, за исключением того, что регулирование рН осуществляют растворЬм гидрата окиси натри без одновременного добавления этиле диаминтетрауксусной кислоты. Пример 3. Ферментацию в кр ном масштабе осуществляют следующим образом. Среда для посевного материала (1-я стадия), г/л: Церелоза (NN4)1 РНО MgS04-HQ O NZ-амин УТ рН-7,0 Среду вводят порциями по 500 мл, в две 2,8-литровые колбы Фернбаха. После обработки в автоклаве и охлаж дения колбы засевают клетками культ Xanthomonas campestris. После встря хивания в течение 3U ч при 28°С содержимое обеих колб объединяют и ис пользуют для засевания бродильного на емкостью 200 галлонов (757,08 п) Посевная среда (2-я стадия), г/л Церелоза10,0 (МН4)гНР042,0 КН2Р040,453, Горькие соли 0,226 NZ-амин УТ рН - 7,0 4,99 Ферментационную среду перемешива механической мешалкой, аэрируют до получения 1,,5 ммоль кислорода н литр в минуту. Через определеные пр межутки времени добавляют раствор г рата окиси натрия для поддержания р на уровне 6,0-7,5. Для регулирования образования изб точной пены дЪбавляют соевое масло. После проведения ферментации в тече ние 48 ч объем смеси, достаточный того, чтобы получить 5 соотношение О объемов, переносят в бродильный бак емкостью 2000 галлонов (7570 л), соержащий 800 галлонов (3028 п) среды следующего состава: Посевная среда ( стадия NH4M03 (50%-ный раствор) , ,8 , кг 12,5 , кг 2,15 Горькие соли, г 306 MgS04H-3,0, г З FeS04-7H O, Г .30,5 Церелоза, кг 79,1 (обрабатывают по отдельности в автоклаве) Изосвит 100, кг 31,75 Безводная лимонная кислота рН 7,О,кг 3,05 После ферментации при вышеупомянуых условиях в течение примерно 31 м бъем, достаточный для получения 10% оотношений объемов, переносят в родильный бак емкостью 2000 галлонов (7570 л), содержащий 1200 галлонов (4163 л).следующей среды: Церелоза, кг (обрабатываются в автоклаве по отдельности ) Изосвит 100, л (50Х-НЫЙ раствор), л ГиДратированный известняк, кг Безводная лимонная кислота, кг 4,53 Na,, , кг 3,17 Горькие соли (Нд504-7НгО), г 454 MgS04-HiO, г 141 Ре504-7Нгб рН -7,0 г 45,4 Таким образом, ферментационный ульон, полученный по известному спообу, обеспечивает получение раствоов для контроля подвижности с конценрацией 100-300 ч. на млн. коллоида сантомонаса и не содержит нераствоимые вещества, имеющее размеры часиц, превышающие 3 мкм. Формула изобретения 1. Способ; получения ферментаионного бульона, используемого для олучения растворов для регулироваия подвижности, применяемых при добыче нефти, предусматривающий культивирование микроорганизмов Xanthomonas campestrts в условиях аэрации на питательной среде, содержащей источник углерода, предпочтительно углеводы, s источники азота, фосфора, воду и другие необходимые микроэлементы, о т ли чающи и ся тем, что, с целью обеспечения отсутствия в целевом продукте практически нерастворимых ве-tO ществ, размеры которых превышают 3,0 мкм, в состав питательной среды дополнительно вводят лимонную кислоту, хелат кальция и ионы железа в виде соли сернокислого железа в количест-, 15 вах соответственно равных 0,5-2,0; 0,02-0,07; 0,0005-0,0025 г/л объема ферментируемой среды.

2.CnocoiS по п. 1,отличающ и и с я тем, что в процессе куль- 20 тивирования в качестве , способствующего образованию хелатных соединений, вводят этилендиамидтетрауксусную кислоту.

3.Способ по п . 1 , о т л и ч а ющ и и с я тем, что после культивирования в ферментационный бульон вводят формальдегид в количестве 0,2-10 г/л.

k. Способ по п. 1, о т л и ч а ю щ и и с я тем, что в качестве источника азота используют нитраты аммония, натрия и калия.

5.Способ по п. 1, о т л и ч а ющ и и с я тем, что вода для приготовлния питательной среды содержит менее чем 20 г/л кальция, и других осаждающих в виде фосфатов катионов.

6.Способ по п. 1, о т л и ч а ющ и и с я тем, что после культивиро.вания ферментационный бульон выдерживают в течение 3-4 дней для получения бульона, практически свободного от нерастворимых частиц, превышающих размер 0,65 мкм. Приоритетпо

05.08.76по пп. 2-5,

03.05.77по пп. 1, 6. .

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1. Патент США № 3 27226, кл, 195-31, опублик. 19б9.