45%-ный раствор полиэтиленгликоля (ПЭГ) с молекулярной массой 6000 до конечной концентрации о7о
Осадок формируется Б течение 4-5 час при комнатной температуре. Возможно дальнейшее формирование осадка в течение 13 час при . Ьыпавший осадок отделяютдеитрифугированиемпри1UOUO об/мик 3 течение мин. Супернатгкт не. содержит HBs-антигена (по дан1ШМ методя йИсуОФ и представлен альбунп.воЕ (по данным метода электрофореза на анега ной пленке).
Получеинь; осадок трехкратно застригируют Б О,) G jn растворе хлористого иатрияБ сбьеме, с;1сгавл,:нзщем 1/10 часть от исходной сыворотки. Э :стракци10 проводят на ма1-к 1шой мешалке в течение 1-2 час н до гледуюашм центрифугированием при 3060-ШООО об/мин в течение 15-20 мин. .После /фехкратной экстракции осадок з дальн,ейшем не используют. Ьсли экстракцию не производят, то осадок устойчив к хранению при с сохранением активности НВа-антигена в течение 1-2 месяцев.
Подготовленный экстракт диализуют против 0,15 М раствора хлористого натрия в течение 24-48 час при 4С. Диализованный экстракт подвергают гель-хроматографии через сефадекс G-200. Используют колоЕку для хроматографии размером 5,ОХ ХбО.О см, предварительно заполненную гелем н зквилабркрозанную 0,15 М раствором хлористого натрия. Гел.ь-хрок.атография ааправлена на получение первого макроглобулярного пика. Фракции, входящие в этот пик, объе.диняют и концентрируют, используя ультрафильтрадию. При проведении- ультрафильтрации целесообразно одновременно подвергать препарат проточному диализу 0,15 .М раствором хлористого натрия.
По окончании ультрафильтрации раствор белка наносят на преформированный ступенчатый градиент хлористого цезия от 1,1 до 1,4 г/см. Ультрацентрифугирование проводят при 25000 об/мин в течение 18 час. Фракции после ультрацентрифугирования разделяют на автоматическом коллекторе и объединяют по наличию в них HBs-антигена в максимальных активностях. ОбъедиХарактеристика препарата
ненные фракции диализуют против 0,15 М раствора хлористого натрия при и концентрируют ультрафильтр а иной.
Полученный препарат наносят на линейный градиент плотности са.харооы от 1U до 20% и подвергают ультрацектрифугированию при 2оОио об/мин в течение 1й час. Но окончаник цeнтpиq)yгиpoвaния срракции, содержащие НВ -анткген, объединяют и диализу1от против 0,1 М Трис-HCi буфера рН 7,2 в течение 24-4ч: час при . Диа.лизованный препарат подвергают аф1.нной хроматографии через Н01;итель, содержащий высскоактиБНые антитела к белкгд крсви человека. Элюат после афиынсй хромвтограф;-и концентрируют ультрафильтрацнсй и диализуют против 0,1 о М раствора .хлористого натр1 я.
К полученному препарату поверхностного антигена гепатита В в соотношении 1 : i добавляют раствор, содержащий 0,132 М е-лейцина и 0,0066 Л1 формальдегида. Для приготовления 100 мл раствора гмикометилольного соединения формальдегида и е-лейцина необходимо приготовить п смешать 50 мл раствора е-лейцина, добавив 1,73 г е-лейцина и 50 мл формальдегида из расчета; 0,1 мл 11,3 М раствора на 85,5мл физиологического раствора.
В случае радиоактивной метки HBs-антигена для подготовки аминометилольного соединения формальдегида используют радиоактивный формальдегид по . Суммарная активность препарата может быть в пределах от 0,1 мк до 10,0 мк и более.
Полученную смесь белка и аминометклолького соединения формальдегида и е-лейцина выдерживают при 22-37°С в течение 72 час, после чего препарат мол4ет храниться при 4°С в течение одного года (срок наблюдения) без изменения активности HBs-антигена с сохранением стерильности раствора.
Для удаления непрореагировавшего аминометилольного соединения препарат подвергают гель-фильтрации через сефадекс G-50 или ультрафильтрации с проточным диализом.,
В таблице приведены результаты, подтверждающие стабильные свойства препарата при хранении.
Активность - антигена (титр в РПГА)
Препарат, обработанный аминометилольиым спедииспием формаль-1егида : е-лейuii;;;i. ч- чр и1ЯО1 имх.ушгеи-пмс .вопгтва вно -iaBiicuMocTH от способа вьслсния, по отпоiiOiiiiK) 1ч пагивниму белку, не no.iBepri;;eмуся одифинацни
Способ 110зв1ляет выделять препарат повер ппст1 ого антигена гепатита В и( сырья, 1ч дер к; 1цегп нл.нчне и BiiicoKSie титры НВ,,антигсна.
Препарат стабилен при храненнн и позволяет хранить его в услов1 Ял бь1тового холодильника i4C} без изменения его антиген1;ых и иммуногенньгх свойств п исключает необходимость хранения препарата npjf низкпх температурах (-20, -40, - 196С), т|1ебую1цих специального оборудоваи; я и э ;ергоресурсов.
Исиользование в качестве сырья для получения препарата поверхностного антигена гепатита В выбракованной крови, содержащей НВ.5-антиген, позволяет экономить в год от 50 до 100 тыс руб.
Формула и -i о б р е т е н и я
Способ П11лучеия iioet рхностноги антигена гепатита В путем обработки плазмы
крови соляной кислотой, отделения осадка, обработки надосадочной жидкости по,лнати.1епглико1ем с последующим выделением целевого проаукта из полученного оеадка и его счисткой концентрирования в градиенте плотности сахарозы и диализа, отличающийся тем, что, с целью поВ1;1шеннн стаби.1ьности целевого продукта в процессе хранения, полученный после обработки полиэти 1енгликолем осадок экстрагируют хлористым натрием, экстракт диалнзуют, затем подвергают гель-хроматографическому фракционированию, отбирают активные фракции, подвергают их улырафильтрации, ультрацентрифугированию Б в хлористом цезии, затем после диализа подвергают афинной хроматографии, полученный элюат концентрируют, диализуют и обрабатывают аминометилольным соединеппем формальдегида и е-лейцика.
Источники информации, принятые во внимание при экспертизе
25 1. Методические рекомендации «Исследование крови доноров на антиген гепатита В, утвержд
43 СССР 11.07,74 г.
название | год | авторы | номер документа |
---|---|---|---|
Способ получения макроглобулина | 1980 |
|
SU961695A1 |
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПОВЕРХНОСТНОГО АНТИГЕНА ВИРУСА ГЕПАТИТА В ИЗ РЕКОМБИНАНТНЫХ КЛЕТОК ДРОЖЖЕЙ HANSENULA POLYMORPHA И ВАКЦИНА ДЛЯ ИММУНИЗАЦИИ ПРОТИВ ГЕПАТИТА В | 2002 |
|
RU2205023C1 |
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СУБЪЕДИНИЧНОЙ ГЕННОИНЖЕНЕРНОЙ ВАКЦИНЫ ПРОТИВ ГЕПАТИТА В | 1992 |
|
RU2067767C1 |
СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ И ОЧИСТКИ ТРОФОБЛАСТИЧЕСКОГО БЕТА-1-ГЛИКОПРОТЕИНА | 2008 |
|
RU2367449C1 |
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ МЕНИНГОКОККОВОГО СЕРОГРУППЫ В ЛИПООЛИГОСАХАРИДА | 1993 |
|
RU2089215C1 |
СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ И ОЧИСТКИ ТРОФОБЛАСТИЧЕСКОГО БЕТА-1-ГЛИКОПРОТЕИНА | 2007 |
|
RU2325171C1 |
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ТИМИЧЕСКИХ ПЕПТИДОВ | 2006 |
|
RU2332423C2 |
Способ получения простатической кислой фосфатазы | 1990 |
|
SU1747488A1 |
Способ выделения раковоэмбрионального антигена | 1984 |
|
SU1363562A1 |
Способ получения поверхностного антигена гепатита В | 1980 |
|
SU944580A1 |
Авторы
Даты
1981-04-07—Публикация
1979-05-24—Подача