1
Изобретение относится к способу получения вагахины, которая может быть испопьзована дпя зашиты поросят от трансмиссивного гастроэнтерита.
Известен способ получения вакцины,
дпя зашиты поросят от трансмиссивного гастроэнтерита путем многократного пересеивания исходного вируса на культуру кпеток почки собаки с интернатом в 24 ч и пи меньше и сбора вирусосодержа- Q шего материала l .
Однако известный способ недостаточно эффективен, поскольку он приводит к ограниченной зашито поросят от инфекционного заболевания.,5
Цель изобретения - повышение эффективности способа.
Поставленная цепь достигается путем 250-ЗОО пересевов исходного вируса на культуре клеток щитовидной железы сви- JQ ней через 1-2 дня при и сбора вирусосодержашего материала.
Было установлено, что еспи вакцину, полученную в соответствии с предлагаемым способом, вводят свиноматкам орапьчно, то оспабпецный вирус продолжает размножаться вдоль всего кишечного тракта животного. Поросята, родившиеся от таких свиноматок, являются полностью зашишенными от воздействия инфекции, вызываемой вирулентным вирусом трансмиссивного гастроэнтерита (ТГЕ) с помощью антител ИгА (имгиуноглобулина - А), соДержашихся в молозиве.
В табл; 1 приведены значения титров антител ИгА проб молозива, определенные в Ходе проведения испытаний с нейтрализацией сыворотки.
Упомянутые пробы центрифугируют, разбавляют физиологическим раствором NaCe (1:10) и нагревают до 4О°С в течение ЗО KfflH. Затем доводят значение рН раствора до 4,6-4,65 с помошью смеси равных объемов 1 н. НСВ и 2М уксусной кислоты, после чего перемешивают полученный раствор в течение 2О мин. После центрифугирования (12,OOOqj и 4°С) осушествляют в течение ночи диализ относительно О,1М трис-гидроксиметапами- номе та на, 0,2М NaCC, рН которого до3.97 водиш ДО 8,0 с помощью 1 н НСЕ. Пробы поспе этого концентрируют до поповины объема в 5% CarbowdX {молекулярный вес 2О,ООО) и вводят в колонку (2,5 100 см) с SephcfdexG-200. Вымывание осуществляют с помощью трис НаСВбуфера, рН 8,0. Таблица 1 ; Титр антител ИгА После введения свиноматкам вируса ТГЕ поспе ЗОО-го пересева, оспабленного в соответствии с изобретеним, в моло зиве обнаружено сравнительно высокое содержание антител ИгА, П р и м ер 1. Исходный вирулентный вирус выделяют из зараженной свиноматки в Dnsti-tut Ur MikrobioEoфе ипсЗ :)nfeciionsi(.pan1 tieHetl сЗег в Мюнхене. Эту исключительно болезнетворную вирусную цепочку (далее В1-цепочка) выделяли непосредственно на живой ткани щитовидной железы свиньи. Клеточные культуры живой ткани шитовидной железы свиньи получали,используя щитовидные железы, полученные со скотобойни Мюнхена. Щитовидные железы поспе удаления их из упаковки и стерили зации поверхности, осуществляемой дважды 95% спиртом, разрезали на кусочки размерами 1-2 мм и промывали их три раза фосфатным буфером (СРБФ), К кусочкам живой ткани добавляли 0,37% трипсин-буферного раствора (не содержащего и ), после чего осушес вляпи фракционную обработку трипсином при температуре 37 С. Первые две фракпии трипсина сливали (после обработки в течение 1 ч), а фракции 3 и 4 (время обработки 1,5 ч) отфильтровывали и хранили при температуре 4°С. По окончании этой обработки суспензию клеточного трипсина центрифугировали Е. течение Ю мин (500 г). Всплывающую на поверхность жидкость спивали, а осадок суспензировали в СРБФ фосфатном буфе84ре и вновь центрифугировали. Клеточный осадок помещали в 10 мп ку 1ьтуральной среды. В качестве культуральной среды использовали раствор соли ЕигСе. Однако можно использовать также и другие подходящие культуральные среды. Среда дгая выращивания содержала 10% сыворотки теленка и 5% поддерживающей среды. Кроме того, среда содержала 5О мл гидролизата лактальбумина на литр среды, и возможно, один или несколько антибиотиков. Рост клеток происходил в обычных сосудах Для выращивания культур, например в плоских стеклянных или пластиковых сосудах. Культуральную среду заменяют после 2-3 дней. После выдер-г живания культуры при в течение 4-6 дней первичные клеточные культуры обычно закрывались слоем клеток. Вторичные клеточные культуры, полученные из щитовидных желез свиньи, использовали для прохождения через них В1-цепочек вируса ТГЕ в вышеупомянутых клетках и для определения инфекционной способности вируса в различных частях тонкой кишки. Упомянутые вторичные клеточные культуры получали вновь путем высевания первичргых клеточных культур при соотношении 1:2. Ослабление вируса осуществляли в результате 250-350 последовательных пересевов на вторичных клетках живых тканей щитовидной железы свиней при 37°С. Упомянутые последовательно пересевы осуществляли обычным образом. На основе патогенного эффекта и с помощью титрований вируса установили, что титр вируса обычно бып максимальным после инкубации в течение 24-28 ч. Пример 2. Для того, чтобы определить влияние последовательных пересевов на мягкой ткани щитовидной жепезы свиней на вирулентность вируса, каждый раз вводили двум разным поросятам из одного приплода свиноматки 2 мл вирусосодержащего материала после 2-го (2x10 ЭЗГ/мп), 120-го (2 10 ЭЗГ/мп), 250-го ( ЭЗГ/млК 300-го (4 х 10 ЭЗГ/мл) и 35О-го (4 Ю ЭЗГ/мл) пересевов. Титры выражены в единицах образования зоны гемолиза на мл (ЕЗГ/мл). В возрасте 1-2 дня экспериментальных животных отнимали от свиноматки, которые обладапи нейтрализующими антителами, обеспечивающими иммунитет против вируса ТГЕ, и поили из бутылки. На второй день жизни поросят заражапи орально путем введения им 2 мл одного из вышеупомянутых вирусов, содержащего материап, попученвыЯ при разпичном чиспе пересевов. Десяти контрольным поросятам давани 2 мп купь турапьной среды. Ход течения клинического забопевания контропировапн два раза в день. Когда поросята оставались живыми на десятый день, у них брали пробу крови для определения содержания антител. Количество антител определяли с помощью теста, основаиного на нейтрализации сыворотки, с использованием способа получения микротитров (Wilte K.H-i/Arcti.cyes Virusforset 1971, 33, S. 171-176). Первое появление поноса рассматривалось как коней инкубационного периода. Рвота наблюдалась только у тех поросят, которым вводили вирус после второго пересева. Для этого пересева инкубационный период составлял 16-18 ч. При боль шем количестве пересевов происходило увеличение инкубационного пе;риода, который достигал для 300-го пересева 80 ч. После заряжения вирусами, вьщержавшкми 2-й, 120-й и 250-й пересев, у поросят появлялся понос, который продолжался в течение нескольких дней. Поросята, которые получили вирус после ЗООго пересева, отличались твердыми экскрементами в течение нескольких дней, в то время как у поросят, получивших вирус после 35О-ГО пересева, вообще не отмечалось никаких симптомов болезни. Поросята, которых заражали вирусом после второго пересева, умерли через i2 дня спустя после введения вируса. Ни один из шести поросят, которым вводили вирус после 12О-ГО пересева, не остался в живых. Из четырех поросят, которым вводили вирус поспе 250-го пересева, уцелел только один. Все животные, зараженные вирусом, полученным после 250-го пересева, выздоровели после болезни, так же как и поросята, которым вводили вирус после-25О пересевов. Из этих результатов можно сделать вывод, что вирулентность вплоть до 250го пересева была только слегка ослаблена, так что болезнь, вызванная инфекцией, оказывалась весьма серьезной, после чего наступила смерть. Пример 3. Этот эксперимент осуществляли с той целью, чтобы определить, где происходит размножение вируса, полученного после различного количества пересевов вируса, ослабненного в соответствии с изобретением, в тонкой кишке. С этой целью осуществляли введет ние новорожденным поросятам вируса после различного количества пересевов, такого же .как и в примере 2 и по той же самой методике. Сразу же после того, как отмечалисьПервые симптомы типичного заряжения вирусом ТГЕ, порбсята, которых держали изолированно друг от друга и заражали каждого по отдельности, были убиты. Начиная от двенадиатиперсной кишки, брались пробы общим количеством Ю штук тонкой кишки, снятые на равных расстояниях 25-35 см. Эти пробы использовали дли того, чтобы определить титр вируса, распространенного на раэяичных участках тонкой кишки. Титр определяли после гомогенизации образца в ступке и центрифугирования 10% суспензии в СРБФ. Из всплывающей жидкости готовили десятикратно разбавленные про-г бы, из которых каждый раз были иикубированы 0,2 мл отдельных проб - 4 труб и, содержащие клетчатую культуру щитовидной железы свиньи. После инкубации Ч течение 7 дней при 37°С отмечался цитопагогенный эффект (ЦПЭ) и провоСали определение- титра в соответствии с методикой Кербера ( lann:зn- 5chm1edebercJ Лгс. Ехр, Pdtlioe Phcirmoico€,162), 1931, r, 48О-482). ,- Как следует из результатов, представленных в вышеприведенной таблице, вирулентный вирус, полученный поспе второго пересева, размножается во всей тонкой кишке но не распространяется в ней. То ® самое относится к вирусам, полученным после 120-го и 25О-го пересевов, Для случая 2-го пересева титры вируса находятся между 0,5 и 1,О ТС ID 5О/О,2 мл, в то время, как титры для вируса после 120-го пересева находятся в пределах от 2,0 и 4,5 Pocg ТС ID 5О/О,2 мл. Подобные же значения тит- . ров были получены для вирусов после . 25О-ГО и-ЗОО-го пересевов. В-противоположность этому можно показать, что . размножение вируса, полученного в результате 35О пересевов, происходит топь- . ко центральной части тонкой кишки. П р и м е р . 4. Опыты проводили с 13 свиньями-самками. В начале опыта все свиньи не содержали антител ТГБ-вируса. У группы Г состоящей из 8 свиньей-самок, иммунитет создавали путем двукратного орального введения вирусиого материала приблизительно за 5 и за 2 недели до ожидаемого опороса. Иммуни- тет наступал при оральном введении 4 мл ирусного материала в кислотостойкой капуле.
7 .9711088
Труппа { (4 свиньи-самки) получалабыл применен дпя заражения поросят всех
половину вирусной дозы орально (2 мл)13 самок на третий день после рождения.
в капсуле и половину - через нос. Вирус- Для этой цели 1 мл суспензии был разный материал был безвреден для свиней.бавлен таким образом, чтобь он содерОдна свинья была контрольной и не s жал 100-1ООО Р f D (заразной дозы для получала вируса.свиней), и эту дозу вводили каждому поВ качестве вирулентного опытного ви-; росенку. . руса был взят штамм Миллера ТГЕ-вируса. После трех пересевов череа .поросятТитр нейтрализации сыворотки свинобыла приготовлена 1О% суспензия тонко 10 матки и поросят после пассивной иммунипротертой тонкой кишки в РВ5. Послезации вирусом, ТГЕВ1-цепочки полученцентрифугирования, разделения на порцииной после ЗОО-го пересева, и количестпо 2 мл и замораживания при температу- во живых поросят,через 15 дней после ре -70р указанный вирусный материал рождения приведены в табл. 2.
Таблица 2
10/10
11/11
9
Группа у 17
29 33 35
; 971108
10 I Продолжение габл, 2
5/5
7/6
9/9
