ШТАММ ГРИБА ASPERGILLUS NIGER - ПРОДУЦЕНТ ЛИМОННОЙ КИСЛОТЫ Российский патент 2002 года по МПК C12N1/14 C12P7/48 C12N1/14 C12R1/685 

Изобретение относится к микробиологической промышленности и касается селекции нового штамма гриба Aspergillus niger ВКПМ F-809 - продуцента лимонной кислоты в условиях глубинного культивирования на любой из питательных сред: среды из сгущенного сока сорго или мелассы, или свекловичного сахара.

Известны штаммы гриба Aspergillus niger - продуценты лимонной кислоты на средах из сгущенного сока сорго /1/, на мелассных /2, 3/ и сахарозо-минеральных средах /4/.

Недостатком известных штаммов является их строгая специфичность к сырью и условиям культивирования, применимость только к той технологии, для которой они были созданы, и отсутствие универсальности.

Известен штамм гриба Aspergillus niger - продуцент лимонной кислоты /5/, способный ферментировать в условиях глубинного культивирования мелассные среды, а также среды из мелассы с добавлением пищевого сахара и сахара-сырца, причем введение сахара в процессе ферментации является технологическим приемом, имеющим целью упрощение процесса (исключение дополнительной подпитки культуры) и активизацию кислотообразования. Введение дополнительного источника углерода в мелассную среду, содержащую комплекс ростовых веществ, не характеризует способность штамма расти на лишенных стимуляторов роста сахарозо-минеральных средах и не свидетельствует об универсальности штамма.

Предлагаемое изобретение направлено на получение нового штамма, обладающего способностью продуцировать лимонную кислоту на питательных средах как на основе растительного сырья (сгущенного сока сорго, мелассы), так и очищенного сахара с достаточно высоким выходом лимонной кислоты.

Селекция штамма, обладающего высокой кислотообразующей активностью на расширенном диапазоне субстратов является основой для создания гибкой технологии по использованию различных видов сырья в одном технологическом процессе и позволит снизить зависимость производства от конъюнктуры на сырьевом рынке.

В качестве прототипа выбран известный штамм Aspergillus niger ВКПМ F-719 - продуцент лимонной кислоты при ферментации питательных сред из сгущенного сока сорго /1/.

Испытания штамма Aspergillus niger ВКПМ F-719 на мелассных и сахарозо-минеральных средах показали, что конверсия сахаров в лимонную кислоту составила 42,0 и 55,0% соответственно, то есть активность биосинтеза лимонной кислоты у штамма на указанных средах недостаточно высокая.

Исходным объектом для получения нового штамма служили культуры гриба Aspergillus niger ВКПМ F-719, сохраняемые в Коллекции ВНИИПАКК.

Для получения нового высокоэффективного штамма Aspergillus niger осуществляли ступенчатую селекцию с использованием мутагенного действия УФ-лучей в дозе 3,3 тыс. эрг/мм² после предварительной обработки конидий гриба химическим мутагеном N-нитрозогуанидином в концентрации 0,5% с длительностью воздействия 15 мин. Комбинированное действие мутагенов использовали в сочетании со стабилизирующим отбором селекционированных мутантов с выделением наиболее устойчивых спонтанных вариантов. Отбор вариантов осуществляли по комплексу признаков: активности кислотообразования на различных средах (сгущенный сок сорго, меласса, сахар), стабильности морфолого-культуральных признаков и урожайности конидий грибных культур.

Наиболее устойчивый и активный мутантный штамм имел светло-бежевую окраску конидий.

Новому селекционированному штамму Aspergillus niger во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов присвоен коллекционный номер ВКПМ F-809.

Культурально-морфологические свойства штамма Aspergillus niger ВКПМ F-809. На сусло-агаре через 5 сут культивирования при 32^oС штамм образует колонию диаметром 9 см. Окраска колонии светло-бежевая. Воздушный мицелий хорошо развит, конидиеобразование обильное. Обратная сторона колонии белая с небольшой складчатостью. Конидиальные головки округлой формы, их диаметр варьируется от 50 до 200 мкм. В центре колонии преобладают конидиальные головки диаметром 85-200 мкм.

Апикальные расширения конидиеносцев округлые или слегка вытянутые диаметром 38•42 мкм. Стеригмы двуслойные. Размеры стеригм первого слоя 10,8 мкм, второго слоя 5,6 мкм. Средний диаметр конидий 3,8 мкм. Окраска конидий светло-бежевая. Конидиеносцы прямые, бесцветные, длиной 418-1570 мкм, шириной 11-15 мкм.

На среде Чапека через 5 сут. культивирования штамм образует колонию диаметром 4 см. Окраска колонии светло-бежевая. Конидиеобразование умеренное по всей поверхности колонии, за исключением аспорогенного края, имеющего белую окраску. Обратная сторона колонии белая, гладкая.

Физиолого-биохимические свойства. Аэроб. Температурный диапазон роста 26-36^oС. Оптимальная температура роста 32^oС. Оптимум рН 6,8-7,2.

Ассимиляция источников углерода: обильный рост на сахарозе, D-глюкозе, фруктозе, D-галактозе; умеренный рост на мальтозе, манните, сорбите; скудный рост на лактозе и крахмале.

Ассимиляция источников азота: штамм усваивает азот органических соединений (белки, пептоны, аминокислоты) и азот минеральных соединений (соли аммония, нитраты).

Генетические особенности: прототроф.

Способ хранения. Штамм сохраняется в виде высушенных конидий (5-8% остаточной влажности) при 18^oС.

Штамм Aspergillus niger ВКПМ F-809 идентифицирован по определению грибов рода Aspergillus /6/.

Сущность изобретения поясняется следующими примерами.

Пример 1.

Для лабораторных испытаний культуру гриба селекционированного штамма Aspergillus niger ВКПМ F-809 выращивают в пробирках на сусло-агаре (концентрация сахара 7 градусов по Баллингу, агар-агар 20 г/дм³, рН 5,8). Через 7 суток выращивания при 32^oС с поверхности культуры снимают конидии, подсушивают до остаточной влажности 5-8% и хранят при комнатной температуре. Высушенные конидии используют как посевной материал для оценки кислотообразующей активности гриба на различных средах.

Подготовка конидий продуцента
Конидии гриба в количестве 0,3 г помещают в 100 см³ среды следующего состава, г/дм³:
Сахар-песок - 50,0
Дигидрофосфат калия - 0,16
Нитрат аммония - 2,5
Сульфат магния, гептагидрат - 0,25
Суспензию конидий в среде помещают на качалку с числом оборотов (160±5) мин^-1 на 5-6 ч при (32±1)^oC для набухания и начала прорастания конидий.

Ферментацию сред на основе сгущенного сока сорго осуществляют в лабораторных условиях при глубинном культивировании штамма на качалке с числом оборотов (160±5) мин^-1 в колбах емкостью 750 см³ при (32±1)^oC.

Приготовление питательной среды для выращивания посевного мицелия 36 г концентрированного сока сорго растворяют в 250 см³ горячей воды, автоклавируют при 0,075 МПа 30 мин, охлаждают до 45-50^oС и стерильно вносят 7,5 см³ 10 мас. %-ного раствора сульфата магния гептагидрата и доводят объем до 300 см³ стерильной водой. Концентрация сахара в среде составляет 50 г/дм³.

Приготовление питательной среды для ферментации
51 г Концентрированного сока сорго растворяют в 250 см³ горячей воды, автоклавируют при 0,075 МПа 30 мин, охлаждают до 45-50^oС и стерильно вносят 5 см³ 10 мас.%-ного раствора нитрата аммония, 0,75 см³ 10 мас.%-ного раствора сульфата магния гептагидрата и доводят объем до 300 см³ стерильной водой. Концентрация сахара в среде составляет 70 г/дм³.

Приготовление питательной среды для подпитки культуры гриба
45 г Концентрированного сока сорго растворяют в 150 см³ горячей воды, автоклавируют при 0,075 МПа 30 мин, охлаждают до 45-50^oС и стерильно вносят 3,4 см³ 10 мас.%-ного раствора нитрата аммония. Объем доводят до 200 см³. Концентрация сахара в среде составляет 100 г/дм³.

Выращивание посевного мицелия
Колбы емкостью 750 см³, содержащие 50 см³ питательной среды, засевают 10 см³ суспензии конидий. Колбы помещают на качалку с числом оборотов (160±5) мин^-1 и выращивают культуру гриба в течение 40 ч при (32±1)^oC.

Ферментация концентрированного сока сорго
Колбы емкостью 750 см³, содержащие 50 см³ питательной среды, засевают 5 см³ культуры посевного мицелия. Колбы помещают на качалку с числом оборотов (160±5) мин^-1 и выращивают при (32±1)^oC в течение первых-вторых суток, затем температуру снижают до 28^oС до конца ферментации. Общая продолжительность выращивания составляет 5 суток.

На вторые и третьи сутки проводят подпитку культуры гриба по 14 см³ питательной среды 1 раз в сутки.

После 5-суточной ферментации культуру гриба инактивируют кипячением в течение 3 мин и определяют концентрацию органических кислот, количество лимонной кислоты, выход ее от сахара.

Данные представлены в таблице.

В качестве контроля использованы результаты по ферментации сред из сгущенного сока сорго с применением штамма Aspergillus niger ВКПМ F-719 (прототип). Сравнительные данные показывают, что новый штамм обеспечивает увеличение конверсии сахаров в лимонную кислоту до 84,1%, и прирост доли лимонной кислоты в сумме синтезируемых кислот до 98,4%.

Пример 2. Подготовку посевного материала и приготовление суспензии конидий осуществляют аналогично примеру 1.

Ферментацию проводят на мелассных средах в лабораторных условиях на качалке с числом оборотов (160±5) мин^-1 в колбах емкостью 750 см³ при (32±1)^oC.

Приготовление питательной среды для выращивания посевного мицелия
Опыты проводят на образце мелассы, имеющей следующие характеристики: сахароза 46 мас.%, СаО 1,1 мас.%, рН 6,3.

Состав среды для подращивания посевного мицелия, г/дм³:
Меласса - 65,2
Гексацианоферрат калия гидрат - 0,14
Оксалат аммония гидрат (для полного осаждения солей кальция из расчета на СаО) - 1,53
Дигидроортофосфат калия гидрат - 0,14
Сульфат магния гидрат - 0,25
Сульфат цинка гидрат - 0,005
Вода водопроводная, дм³ - До 1
рН - 6,7
Для приготовления питательной среды навеску мелассы растворяют в воде, нагретой до 80-100^oС в соотношении 1:1, поле чего вносят оксалат аммония гидрат и гексацианоферрат калия гидрат в количествах, указанных выше. Объем раствора доводят до заданного водой. Требуемое значение рН устанавливают с помощью карбоната натрия, либо серной кислоты. Раствор стерилизуют в автоклаве при 0,1 МПа 30 мин, охлаждают до 30-34^oС и вносят стерильные растворы солей дигидроортофосфата калия и сульфатов магния и цинка.

Концентрация сахара в среде 30 г/дм³.

Приготовление питательной среды для ферментации
Для ферментации приготавливают питательную среду, содержащую 30 г/дм³ сахара, по прописи, указанной выше, но без добавления сульфата магния. Количество оксалата аммония гидрата сокращают в 2 раза.

Приготовление питательной среды для подлива
Состав среды, г/дм³:
Меласса - 543,0
Гексацианоферрат калия гидрат - 2,58
рН - 6,3
Концентрация сахара в среде, г/дм - 250
Выращивание посевного мицелия
Колбы емкостью 750 см³, содержащие 50 см³ питательной среды, засевают суспензией конидий в количестве 10 см³. Колбы помещают на качалку с числом оборотов (160±5) мин^-1 и выращивают культуру гриба в течение 24 ч при (32±1)(С.

Ферментация мелассных сред
Среду, приготовленную для ферментации, разливают по 50 см³ в колбы емкостью 750 см³ и вносят по 10 см³ посевного мицелия. Колбы помещают на качалку с числом оборотов (160±5) мин^-1 и выращивают культуру гриба в течение 5 суток. В процессе ферментации после 24 ч культивирования проводят подпитку культуры гриба в два приема в течение суток и интервалом не менее 5 ч.

В один прием в каждую колбу вносят по 10 см³ мелассного раствора. Общий объем подпитывающего раствора составляет (20±1) см³.

После 5-суточной ферментации культуру гриба инактивируют кипячением в течение 3 мин и определяют концентрацию органических кислот, количество лимонной кислоты и выход ее от сахара.

Данные представлены в таблице.

В качестве контроля использованы результаты по ферментации мелассных сред с применением штамма Aspergillus niger ВКПМ F-719 (прототип). Сравнительные данные показывают, что в результате селекции нового штамма показатели процесса ферментации существенно возросли: конверсия сахара в лимонную кислоту составила 62,9%, массовая доля лимонной кислоты в сумме кислот увеличилась до 88,0%.

Пример 3. Подготовку посевного материала и приготовление суспензии конидий осуществляют аналогично примеру 1.

Ферментацию проводят на сахарозо-минеральных средах в лабораторных условиях на качалке с числом оборотов (160±5) мин^-1 в колбах емкостью 750 см³ при (32±1)^oC.

Приготовление питательной среды для выращивания посевного мицелия
Для выращивания посевного мицелия используют среду следующего состава, г/дм³:
Сахар-песок - 50,0
Меласса свекловичная - 17,0
Нитрат аммония - 2,5
Дигидроортофосфат калия гидрат - 0,16
Сульфат магния гидрат - 0,25
Вода водопроводная, дм³ - До 1
рН готового раствора - 5,0-5,5
Раствор сахара с добавлением мелассы стерилизуют в автоклаве при 0,05 МПа 30 мин. Мелассу добавляют в посевную среду для стимуляции роста посевного мицелия гриба. В охлажденный до 32^oС сахарный раствор вносят стерильные растворы солей; готовую питательную среду разливают в колбы по 60 см³ с соблюдением условий стерильности.

Приготовление питательной среды для ферментации
Для ферментации используют питательную среду того же состава, что и для подготовки посевного мицелия, но с увеличением содержания сахара до 150 г/дм³ и исключением мелассы. Среду, приготовленную для ферментации, разливают по 50 см³.

Выращивание посевного мицелия
Колбы емкостью 750 см³, содержащие 60 см³ питательной среды, засевают суспензией конидий в количестве 10 см³. Колбы помещают на качалку с числом оборотов (160±5) мин^-1 и выращивают культуру гриба в течение 48 ч.

Ферментация сахарозо-минеральных сред
Питательную среду для ферментации засевают 10 см³ посевного мицелия гриба. Колбы помещают на качалку и выращивают культуру гриба в течение 5 сут. при (32±1)^oC.

Подпитка культуры не производится.

После 5-суточной ферментации культуру гриба инактивируют кипячением в течение 3 мин и определяют концентрацию органических кислот, количество лимонной кислоты и выход ее от сахара.

Данные представлены в таблице.

В качестве контроля использованы результаты по ферментации сахарозо-минеральных сред с применением штамма Aspergillus niger ВКПМ F-719 (прототип).

Сравнение результатов ферментации показывает, что селекционированный штамм Aspergillus niger ВКПМ F-809 существенно превосходит прототип по всем показателям процесса: конверсия сахара в лимонную кислоту составляет 87,25%, массовая доля лимонной кислоты - 100%.

Таким образом, в результате селекционных работ получен штамм Aspergillus niger ВКПМ F-809 - продуцент лимонной кислоты, обладающий универсальностью, ферментирующей при глубинном культивировании питательные среды: сгущенный сок сорго, мелассу, сахар с высокими показателями.

Источники информации
1. Патент РФ 2088658, МПК 6 C 12 N 1/14, 1997.

2. Патент РФ 1315472, МКИ 4 C 12 N 1/14, 1987.

3. Патент РФ 975799, МКИ 3 C 12 N 15/00, 1982.

4. Патент СССР 1811697, МПК 5 C 12 N 1/14, 1993.

5. Патент РФ 2088665, МПК 6 C 12 P 7/48, 1997.

6. Билай В. И., Коваль Э.З. Аспергиллы. - Киев: Наукова Думка, 1988. - 204 с.

Селекционированный штамм Aspergillus niger ВКПМ F-809 используется для производства лимонной кислоты в условиях глубинного культивирования. Штамм обладает высокой кислотообразующей активностью на расширенном диапазоне субстратов: среде из сгущенного сока сорго, мелассной и сахарозо-минеральной среде. Конверсия сахаров названных питательных сред в лимонную кислоту составляет соответственно 84,1; 62,9 и 87,25%. Штамм является основой для создания гибкой технологии по использованию различных видов сырья в одном технологическом процессе и позволяет снизить зависимость производства от конъюктуры на сырьевом рынке. 1 табл.

Штамм гриба Aspergillus niger ВКПМ F-809 - продуцент лимонной кислоты.